Штамм бактерий РSеUDомоNаS рUтIDа - продуцент L - метионина Советский патент 1992 года по МПК C12P13/12 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/40 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, продуцируемого L-метионин, который может быть использован в качестве добавки в корм животным и как лекарственный препарат.

Известен штамм бактерий Согупе- bacterium glutamicum АТСС 21608 - продуцент L-метионина, Штамм получен путем селекции на устойчивость к ингибирующему действию 10 структурных неметаболизй руемых аналогов аминокислот и является ауксотрофным по треонину. При его использовании максимальное накопление метионина (3,4 г/л) достигается за 72 ч ферментации.

Недостатком штамма является его аук сотрофность по треонину, требующая экзогенного внесения треонина или его

источника в среду культивирования, что удорожает ее. .

Известен штамм бактерий Pseudomonas sp. - продуцент L-метионина. Штамм получен путем селекции на устойчивость к ингибирующему действию двух неметабо- яизируемых аналогов (DL-этионину и L-ами- но-уЗ-оксивалериановой кислоте). Штамм продуцирует 0,400 г/л метионина.

Недостаток штамма - низкий уровень образования метионина.

Целью изобретения является получение прототрофного штамма бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-4167, обладающего более высоким уровнем биосинтеза L-метионина по сравнению с известными.

Штамм получают следующим образом.

Бактериальную суспензию выращивают до начала логарифмической фазы роста (2-3 108 клеток/мл) в бульоне на качалке.

VI

CJ

о

СП

го

Клетки собирают центрифугированием, отмывают и ресуспендируют в 0,1М MgS04. Для синхронизации бактериальной культуры ее помещают на 5 мин в холод. Ультрафиолетовое облучение культуры проводят в чашках Петри в присутствии неметаболизи- руемого аналога (этионина) при равномерном перемешивании дозой 13,5 кДж/м в течение 15 мин. Культуру бактерий, прошедшую мутагенез, высевают на градиент неме- таболизируемого аналога целевой аминокислоты.

Градиент аналога приготавливают следующим образом.

0,4%-ную агаризованную минимальную питательную среду М9 разделяют на две части, В одну из частей добавляют аналог метионина-ОЬ-этионин в концентрации 15 мг/мл и выливают в пластмассовый стерильный пенал, установленный в наклонном положении, в результате чего агар застывает в виде клина. После того, как среда застывает, пеналы устанавливают горизонтально и выливают в расплавленном состоянии оставшуюся агаризованную среду. Таким образом, в агаризованной среде возникает градиент. На поверхность застывшей среды, содержащей меньшую концентрацию аналога, высевают культуру бактерий. После инкубирования при 30°С в течение 7 дней отбирают биомассу клеток, наиболее далеко переместившихся на градиенте этионина, и клонируют на богатой питательной среде. Полученные таким образом отдельные клоны, устойчивые к этио- нину, испытывают на способность к избыточному синтезу метионина с помощью ауксонографического теста и ферментации. Лучшим из отобранных клонов был.Р. putida ВКПМ В-4167.

Штамм хранят следующим образом.

1 способ - хранение под маслом.

Выращенную на скошенном мясо-пеп- тонном агаре культуру заливают вазелиновым маслом так, чтобы .его слой не превышал скошенный край среды. Хранение культуры под маслом осуществляют в холодильнике при.(+ 4)-(+ 6)°С. Периодичность пересевов - раз в год.

.2 способ - хранение клеток в лиофили- эированном состоянии.

Культуру клеток выращивают в оптимальных условиях до начала стационарной фазы роста. Затем суспендируют в защитной среде, разливают по ампулам по 0,5-1,0 мл, замораживают при температуре от -20 до -70°С, высушивают и упаривают под вакуумом. Ампулы с лиофильно высушенными клетками хранят в темноте при 4-брС. Срок хранения - несколько лет.

Штамм имеет следующие характеристики.

Культура л ьно-морфол о гические признаки.

Прямые палочки размером 0,5-2,0 мкм,

подвижные (многотрихи), располагаются одиночно, грамотрицательные, неспорооб- разующие. Мясо-пептонный агар (МПА): через 24 ч роста при 28°С колонии с ровными краями, круглые, блестящие, гладкие, выпуклые; консистенция однородная, диаметр колоний 1-3 мм.

Агаризованная минимальная среда Адамса: через 40-42 ч при 28°С колонии диаметром 0,5-1 мм.

Рост в мясо-пептонном бульоне: после 24 ч культивирования при непрерывной аэрации и перемешивании сильное равномерное помутнение, запах характерный. Физико-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода (см. таблицу):

Отношение к источникам азота: усваивает азот в форме аммония и солей азотной кислоты.

Желатин не разжижает. Протеолиз казеина отсутствует. Крахмал и поли-уб-оксибутират не гидро- лизует. Липолитической активностью не облаДает

Оксидазная реакция положительная.

Обладает аргинингидролазной активностью.

Образование левака из сахарозы не происходит.

Сероводород не образует.

Образует каталазу.

Не образует пиацианин и другие фена- зиновые пигменты.

Синтезирует желто-зеленые флюоресцирующие пигменты.

Аэро.б.

Температурный диапазон роста - (+10)- (+30)°С; оптимум роста - 25-30°С. .

Растет в средах с рН 6,8-7,5; оптимальное значение рН 7,0. .

Предлагаемый штамм характеризуется устойчивостью к ингибирующему действию DL-этионина (10 мг/мл), способен накапливать в среду ферментации до 3,5 г/л метионина. При выращивании на посевной и ферментационной среде не нуждается в эк- зогенных аминокислотах. Одним из важных свойств предлагаемого штамма-продуцента является его способность к избыточному синтезу только метионина (2,3 г/л), хотя в среде культивирования идентифицировали

не только метионин, но и его окисленную форму - метионинсульфоксид (1,2 г л ).

Получение L-метионина с использованием предлагаемого штамма-продуцента осуществляют следующим образом.

Штамм выращивают на МПА и полученной суспензией клеток засевают жидкую посевную или ферментационную среду. Выращивание посевного материала ведут при 28-30°С, рН 6,8-7,2 и непрерывном аэрировании и перемешивании. Приготовленный таким способом посевной материал или суспензию клеток, смытых с агара, используют для засева ферментационной среды, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли.

Ферментацию осуществляют в аэробных условиях при 25-28 С в течение 72 ч. Определение содержания метионина в культуралъной жидкости проводят с помощью метода бумажкой хроматографии в системе растворителей: бутанол -уксусная кислота - вода (8:3:1), а также методом хроматографии на пластинках Silufol в той же системе растворителей.

Пример. Штамм выращивают в течение 24 ч при 28°С на МПА, затем ресуспен- дируют и суспензию с титром 108 кл/мл используют для засева посевной среды сле- дующего состава, г/л: глюкоза 10; MgSQ 0,4; (МН4)25См 0,5; FeCIa 7Н20 0.002; MgCte 5Н20 0.002; KHaPOn 1; вода остальное.

Посевной материал выращивают в тече- ние 28 ч в колбах емкостью 300 мл с 50 мл посевной среды на качалке (200-220 об./мин). Выращенным посевным материалом с титром 6-8 109 кл/мл засевают ферментационную среду, Состав ферментационной среды, г/л:(МН4)250410; КН2РСм1; KCI 2, МдЗСм 7Н20 0,4; глюкоза 100; мел 25; водопроводная вода; рН 7,0.

Ферментацию проводят при аэрировании и перемешивании со скоростью 220- 230 об./мин и 26-30°С. После 72 ч культивирования в ферментационной среде накапливается 3,5 г/л L-метионина.

Фор мула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-4167 - продуцент L-метионина.

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, продуцирующего L-метионин, который может быть использован в качестве добавки в корм животным и как лекарственный препарат. Целью изобретения является получение прототрофного штамма бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-4167, обладающего более высоким уровнем биосинтеза L-метионина по сравнению с известными. Штамм способен накапливать в ферментационной среде до 3,5 г/л L-метионина, не нуждается в экзогенных аминокислотах, устойчив к ингибирующему действию DL-эти- онина в концентрации 10мг/мл. 1 табл. mS Ё