Способ получения L-треонина Советский патент 1982 года по МПК C12P13/08 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения L-треонина.

Треонин является незаменимой аминокислотой, KOTOijaH широко применяется как кслтонент различных питательных смесей медицинского назначения. Кроме того, L-треонин может быть использован в качестве добавки в пищу человека и в корм животных, а так же как реактив для фармацевтической и хшлической промышленности. J В настоящее время L-треонин получеиот путем прямой ферментации без предшественников с использованием штаммов продуцентов таких видов как Brevibacterium fBavum, Escherichla coCi, Corinebacterium acetoaci- dophlEum, Proteus rettgeri,, Serra- fia marcegceus, Aerobacter aerogehes, Corynebacterium gEuteimicvim на питательных средах, содержащих в качестве источников углерода глюкозу, фруктозу, ацетат, этанол или добавления витаминов и аминокислот или их содержащих субстратов, а также содержащих источники азота и необходимые минеральные соли.

Известен способ получения fi-треонина с использованием мутантных

штаммов Escherichia coEi при глубинном культивировании на питательных средах, содержащих углеводы, источники азота, минеральные соли при добавлении в среду чистых аминокислот и витаминов или содержащих их гйдролизатов белковой массы. При этом достигнут максимальный выход 10,4 г/л L-треонина в ферментационной среде

10 за 96 ч ферментации 1.

Однако применяемые мутантные штаммы Escherichia характеризуются потребностью в изолейцине или в изолейцине и метионине.

15

Известен также способ получения L-треонина путем культивирсвания продуцирующих его микроорганизмов вида Escherichia co8iHa питательной среде, содержащей источники уг20лерода, азота и необходимые минеральные соли в присутствии антибиотика с последуюо;.им вьщелением целевого продукта Г23.

Общим недостатком описанных

25 способов является невысокий уровень накопления L-треонина на углеводах, в частности на глюкозе, которая является предпочтительным сырьем при . прсизводстве L-треонина для медицин30ских целей, крсяле того, слишком большое время ферментации (96-120 на этом сырье. Цель изобретения - повышение вы хода продукта и сокращение времени ферментации. Поставленная цель достигается т что согласно способу в качестве микроорганизмов, продуцирующих Lтреонин, из вида Escherichia coBi используют штамм Escherichia coKi ВНИИгенетика М-1, а в качестве антибиотика - пенициллин. При этом пенициллин вносят в ис ходную питательную среду в количестве 0,1-0,5 г/л. Кроме того, культивирование ведут на питательной среде, содержащей питательную добавку в виде гид рол из а та белковой массы, например кислотного гидролизата, ферментолизата или автользата дрожжей. Причем в процессе культивирован целесообразно вводить сбалансированную подпитку, содержащую глюкозу и раствор аммиака. Штамм ВНИИгенетика М-1 отобран в рассеве штамма VL 334 р yN 7. От исходного штамма он отличается заметным мукоидным характером поверх ности колоний, повьвденной способностью к продукции треонина, более высокой стабильностью при росте на средах с питательными добавками, т,е, способностью популяции клеток сохранить основные свойства (продукция треонина и устойчивость к пенициллину) после культивирования Е этих условиях. Штамм депонирован в Центральном музее прогллшленных микроорганизмов при институ ВНИИгенетика и имеет регистрационный номер ЦМПМВ-1856, Штамм ВНИИ-генетика М-1 сохраня ет полезные генетические свойства исходного штамма ВНИИгенетика VL 334 р YN 7 (способность к сверх синтезу треонина и .устойчивость к пенициллину, что определяется со держанием в клетках амплифицирован ной гибридной плазмиды pYN 7), но отличается от него рядом морфологи ческих признаков, более высокой ст бильностью сохранения своей популя ции клеток в ходе ферментации на средах с питательными добавками и способностью к более высокому ур ню накопления L-треонина, Введение в исходную питательную среду пенициллина 0,1-0,5 г/л позв ляет использовать обогащенную пита тельными веществами среду без поте ри основных свойств штамма и тем с мым резко повысить скорость наращи вания биомассы в начальной стадии ферментации, за которой следует процесс интенсивного биосинтеза L-треонина, Предлагаемый способ предусматривает ведение процесса ферментации в оптимальных условиях, за счет поддержания в ходе процесса оптимального соотношения углерода и азота и постоянного уровня рН, что достигается путем введения в ходе ферментации сбалансированной подпитки, содержащей глюкозу и раствор .аммиака. Предлагаемый способ позволяет получить в ферментерах емкостью 0,5 л до 30 г/л L-треонина за 40 ч ферментации на питательной среде, содержащей глюкозу, минеральные соли и питательные добавки в виде гидролизата, ферментолизата или автолиз ата биомассы дрожжей при добавлении в исходную питательную среду пенициллина 0,1-0,5 г/л. Характеристика штамма Escherichia coEi ВНИИгенетика М-1, Штамм Escherichia соеiВНИИгенетика М-1, продуцирующий L-треонин хранится в Центргшьном музее промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика и имеет регистрационный номер В-1856, Морфологические признаки, ГраМотрицательные слабо подвижные тонкие палочки с закругленньвли концами, размером 1,5-2 мм в длину, Культуральио-физиологические признаки, Мясо-пептонньЯ агар. Через 24 ч роста при 37С образует круглые, беловатые, полупрозрачные на свет колонии, диаметром 2-3 мм, поверхность колонии . гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется, Агаризованная минимальная среда (Адамса) с глюкозой. Через 2-е сут роста при образует колонии диаметром 1-1,5 мм, серовато-белые, круглые с ровными краями, слегка выпуклые, внутренняя структура однородная, поверхность блестящая, через 4-5 сут колонии приобретают слизистую (мукоидную)консистенцию. Рост в мясо-пептонном бульоне, После 24 ч роста при 37°С наблюдается сильное помутнение, небольшой осадок, запах характерный. Рост в жидкой минимальной среде Адамса, Через двое сут роста при 37°С с аэрацией наблюдается сильное равномерное помутнение, запах отсутствует , Рост по уколу в мясо-пептонном агаре - хороший по всему уколу, Желатину - не разжижает, На молоке - хороший рост с коагуляцией молока, Индол - образует. Рост на различных углеводах. Хорошо растет, на глюкозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе. Фруктозе, глицероле и маннитоле с образовани кислоты и газа. Устойчивость к антибиотикам. Ус тойчив к пенициллину. QlTctMM не патогенен. Содержание плазмиды. В логарифмической стадии роста клетки содер .жат около 17 копий плазмиды pyN 7 (мол.вес 5,7 мегадальтон), обеспечивающей устойчивость штамма к пенициллину и несущей гены треонинового оперона. Потребность в факторах роста. Растет на минимальной глюкозо-соле вой среде (время генерации 240 мин Рост стимулируется изолейцином (вр мя генеращи 60 мин) . . Способ осуществляется следующим образом. Посевной материал культуры микроорганизма Escherichia co8i ВНИИгенетика М-1 выращивают в течение 48 ч на агаризованной минимальной среде, содержащей пенициллин (500 мкг/мл), и затем смывом физиологическим раствором клеток с поверхности косяка готовят клеточную суспензию, которую используют для засева ферментационной среды. Начальная концентрация клеток в рабочем ферментере может составлять около 2-5-10 кл/мл. Исходная питательная среда содержит глюкозу, минеральный азот., соли, пенициллин и питательные добавки в виде гидролизатов белковой массы, например кислотных гидролизатов . автолизатов или ферментализатов дрожжей. Начальный рН среды устана ливают на уровне 7,0-7,2 и затем автоматически поддерживают в этих пределах в ходе ферментации с помощью датчика рН путем введения сбалансированной подпитки, содержащей аммиак (водный раствор) и глюкозу. В виду того, что снижение рН среды в ходе культивирования продуцента треонина обусловлено уменьшением концентрации аммония (азота) в среде вследствие, утилизации его продуцентом, а соотношение между скоростями утилиза азота и глюкозы остается примерно постоянным, то соотношение между к личеством данных компонентов в пит тельной смеси должно соответствовать соотношению между скоростями утилизации этих компонентов культу продуцентом, что и достигается пу выделения в ходе ферментации выше указанной подпитки. Температуру п держивают на уровне 35-37 С. Чере 40-43 ч ферментации образованный питательной среде L-треонин выдел ют следующим методом. Биомассу кл ток продуцента отделяют либо qena рированием, либо фильтрованием по ле предварительной обработки окисью кальция (известковым молоком) и ортофосфорной кислотой. С учетом содержания треонина и катионов в нативном растворе, а также пигментных соединений нативный раствор пропускают через ряд последовательно соединенных колонн с осветляющим сорбентом для поглощения окрашенных соединений и сульфокатионитом, например, КУ-2-8, Диайон SK-IB или другим аналогичного типа в Н-форме, для сорбции катионов и треонина. Сорбированный треонин эллюируют с колонны с сульфокатионитом раствором аммиака. Фракции элюата, содержащие основное количество треонина, упаривают под вакуумом, охлаждают и кристаллизуют-.- треонин. Для ускорения кристаллизации может быть использовано добавление спирта. Полученный трионин хроматографически однороден и содержит 97-99% основного вещества. Для получения препаратов для медицинских целей достаточно провести дополнительную перекристаллизацию. Такие препараты могут быть использованы в средах для культивирования клеток тканей. Выход по предлагаемому методу 80-95%. При высокой концентрации треонина в культуральной жидкости (выше 18 г/л) относительно низком содержании примесей треонин может быть выделен без использования стадии сорбции на ионитах. Для этого осветленный раствор концентрируют уравниванием в вакууме при невысоких температурах и кристаллизуют треонин при пониженной температуре с добавкой или без добавки этилового спирта. После перекристаллизации получают L-треонин с содержанием основного вещества 99%. Пример 1. Посевной материал культуры продуцента Escherichia coEi ВНИИгенетика М-1 выращивают в течен ие 48 ч на агаризованной минимальной глюкозосолевой среде, следующего состава, г/л: глюкоза 5,0; NH4Ce 1,0; КН7.РО4 1,5; 3,5; MgS04.7110 0 0,1; пенициллин 500 мкг/мл, агар-агар 20,0; вода дистиллированная, рН 7,0-7,2. Глюкоза и пинициллин стерилизуются отдельно и добавляются в расплавленную среду перед ее охлаждением и посевом. Выросшую культуру смывают стерильной водопроводной водой,: И полученную клеточную суспензию используют для засева ферментеров... Ферментацию проводят на лаборатор- ном ферментере емкостью 0,5 л. Состав исходной питательной средаг, об.%: (NH4)«iS04 K,i HP040,2% MgSO40,04% Кислотный гидролизат БВК (в расчете на сухой вес). 0/3% Пеногасйтель0,1% Питательную среду стерилизуют с меотно с аппаратом, после чего -ввод в среду стерильную глюкозу 2% и пе нициллин 0,5 г/л. Ферментацию веду при температуре 35-37 С с ведением сбалансированной подпитки, содержа щей аммиак в количестве 2,5-2,7% и глюкозу в концентрации 35%. Подпит ку вводят по сигналу датчика рН. Уровень рН устанавливают в пределах 7,0-7,2, сульфитное число фермента 3,5-4,0 г .ч. Через 40 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается L-треонин в количестве 30 г/л. Затраты глюкозы на синтез треонина б г/г. Далее L-треонин выделяют из куль туральной жидкости. Для этого к 300 мл культуральной жидкости с кон центрацией треонина 30 г/л прибавляют при перемешивании 3 г окиси кальция и затем добавляют ортофосфо ную кислоту до достижения величины рН 5,6, раствор нагревают до выдерживают 10 мин и отделяют биомассу на фильтре под вакуумом. Полученный нативный раствор (оптическая плотность 0,4 при 525 нм в 1 см кювете) пропускают через колонку с 50 мл осветляющей смолы ИА-1р и осветленный раствор (оптическая плотность 0,08) пропускают через колонку со 150 мл сульфокатионита КУ-2-8 в Н - форме, колонку прсалывают 300 мл воды. Сорбированный треонин элюируют раствором 3%-ного аммиа- ка, элюат упаривают под вакуумсил до содержания сухих веществ 25%, до бавляют этиловый спирт в соотношении 1:1 и оставляют кристаллизовать ся в течение 10 ч при температуре +5®С. Кристаллы L-треонина отфильтровывают, промывают и сушат. Получают 8,1 г Ь-треонина (выход 90%). Анализ методом ТСХ (10 мкг) показывает отсутствие других аминокислот. Пример 2. Посевной материал культуры продуцента Escherichia coBi ВНИИгенетика М-1 приготавливают по примеру 1. Ферментацию ведут -на ферментере емкостью 0,5 л. .Состав исходной питательной среды по примеру 1 за исключением того, что в качестве питательной добавки используют ферментолизат БВК в коли честве 0,6 % вместо кислотного гидролизата БВК. Условия ферментации как в примере 1, Через 41 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается L-треонин в количестве 29 г/л. Далее L-треонин выделяют из культуральной жидкости. Для этог 300 мл нативного раствора треонина после отделения клеток продуцента центрифугированием культуральной жидкости (сухих вицеств в нативном растворе 7,5% оптическая плотность 0,6 (525 мм) упаривают под вакуумом при 50с до объема 50 мл, добавляют такой же объем этилового спирта и кристаллизуют треонин в течение 5 ч при .. Полученные кристаллы отделяют фильтрованием, промывают 15 мл этилового спирта и сушат. Получают 6,1 г L-треонина, не содержащего по анализу методом тех (10 мкг) примесей других аминокислот . П р и м е р 3. Посевной материал культуры продуцента Escherichia сов1 ВНИИгенетика М-1 приготавливают по примеру 1. Ферментацию ведут на ферментере емкостью 2 м. Состав исходной питательной среды по примеру 1, за исключением того, что в качестве питательной добавки в питательной среде испсльзуют автолизат дрожжей в количестве 0,4%, а содержание пенициллина 0,2 г/л. Через 43 ,ч ферментации в культуральной жидкости накапливается 18 г/л треонина. Расход глюкозы - по примеру 1. Таким образом, предлагаемый способ превосходит по эффективности все известные спосббы получения L-треонина на углеводной среде. За 40-43 ч ферментации с использованием нового штамма Escherichia coEi ВНИИгенетика М-1 на обогащенной питательной среде с добавлением пенициллина в исходную питательную среду, способ позволяет получить в культургшьной жидкости до 30 г/л L-треонина без примесей других аминокислот. Формула изобретения 1.Способ получения L-треонина путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов вида Escherichia coCi на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и необходимые минеральные соли в присутствии антибиотика, с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода L- треонин а и сокращения времени ферментации, в качестве микроорганизмов, продуцирующих Lтрернин, из вида Escherichia coCi используют штамм, Escherichia coCi ВНИИгенетика М-1, а в качестве антибиотика - пенициллин. 2.Способ по П.1, от л и ч а ющ и и с я тем, что пенициллин вносят в исходную питательную среду в количестве 0,1-0,5 г/л.

3. Способ по п.1, отличающий с я тем, что кульхиЕировани ведут иа питательной среде, содержащей питательную добавку в виде гидролиэата белковой массы, например кислотиого гидролиэата, фермеитояизата или автолиэата дрожжей. , 4. Способ по П.1, отличающийся тем, что в процессе культивирования вводят сбалансированную подпитку, содержгицую глюкозу и раствор аммиака.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

,1. Патент Англии И 1223470 кл. С 2 С, опублик, 1971.

.2. Заявка ФРГ I 1792495, .кп. С 12 D 13/06, опублик. 1972.