Способ получения L-треонина Советский патент 1990 года по МПК C12P13/08 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения аминокислоты L-треонина.

Известен способ получения L-треонина, предусматриваюн5ий культивирование его продуцентов бактерий Escherchia coli на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и антибиотик, с после.дующим выделением целевого продукта.

Недостатком известного способа является невысокий уровень накопления треонина, а также большая продолжительность ферментации.

Ближайшим техническим решением по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения

L-треонина, предусматриваюпщй приготовление посевного материала путем вырапщвания продуцентов треонина бактерий Escherchia coli в посевной питательной среде, введение посевного материала в ферментационную питательную среду, содержащую источники углерода, азота и минеральные соли, добавление гидролизата белоксодержащего субстрата с последующей ферментацией

в глубинных условиях.

Сущность способа заключаемся в том, том, что в качестве продуцента Lтреонина используют штамм микроорганизмов Escherchia coli ВНИИ генетики М-1, содержащий амплифицированную гибридную плазмиду, а в ферментационную .среду вводят питательную добавку

в виде гидролизатов белоксодержащих субстратов и процесс ферментации ведут в присутствии пенициллина. Посевной материал выращивают в присутствии пенициллина и в виде клеточной суспензии вводят непосредственно в ферментационную среду.

Недостатком этого способа является сравнительно высокий расход таких компонентов ферментационной среды, как глюкоза, пенициллин и гидролизат белоксодержащих субстратов.

Целью -предлагаемого изобретения является расширение сырьевой базы, а также удешевление способа.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения 1.-трёонина, предусматривающем проведение приготовления посевного материала путем выращивания продуцентов треонина бактерий Escherchia coli в посевной питательной среде, введения посевного материала в ферментационную питательную среду, содержащую источники углерода, азота и минеральные соли, добавления гидролизата белоксодержащего субстрата и последующую ферментацию в глубинных условиях, в качестве продуцента треонина используют штамм Escherchia coli ВНИИгенетика 472Т, при этом выращивание продуцентов осуществляют в жидкой посевной среде, а добавление гидролизата белоксодержащего субстрата осуществляют непосредственно в посевную питательную среду.

Сущность предлагаемого способа заключается в следуняцем.

Штамм E.coli ВНИИ генетика 472Т получен на основе штамма E.coli ВНИИ генетика М-1 путем введения в клетки этого штамма генетических детерминантов усвоения сахарозы с последующей селекцией на устойчивость к треонину и гомосерину. В качестве донорного штамма, имеющего детерминанты усвоения сахарозы, использовали соответствующий штамм E.coli; в частности, штамм Н-155.

Указанные детерминанты методом конъюгации были введены в штамм E.coli 458 требукяций для роста треонин, метионин и устойчивый к стрептомицину, а затем из штамма 458 таким же методом - в штамм ВНИИгенетика Ml, продуцирунмций треонин. Отбор рекомбинантов вели на минимальной среде, содержащей сахарозу в качестве единственного источника углерода. В результате был отобран штамм ВНИИгенетика 472, который сохранил способность продуцировать треонин на среде с глюкозой и приобрел способность к накоплению этой аминокислоты на среде с сахарозой или мелассой. В связи с тем, что рост этого штамма подавлялся в присутствии высоких концентраций треонина и гомосерина в среде, были получены спонтанные мутанты, устойчивые к этим аминокислотам при содержании их в среде в количестве более 0,5 г/л. Среди указанных мутантов был отобран штамм ВНИИгенетика 472Т.

Характеристика штамма Escherchia coli ВНИИгенетика 472Т.

Штамм E.coli ВНИИгенетика 472Т, продуцирующий 1-треонин, хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика и имеет регистрационный номер ЦМ11М В-1960.

Морфология. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами, размером 1,5-2 мм в длину.

Культурально-физиологические признаки .

Мясо-пепТонный агар. Через 24 ч роста при образует круглые беловаТые, полупрозрачные колонии диаметром 1,5-3 мм, поверхность колонии гладкая, слегка блестящая, края ровные или немного волнистые, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.

Агаризованная минимальная среда Адамса с глюкозой. Через 40-48 ч роста при 37°С образует колонии диаметром 0,5-1,5 мм, серовато-белые, слегка выпуклые, с блестящей поверхностью через 4-5 суток колонии приобретают слизистую консистенцию.

Рост в мясо-пептонном бульоне. После 24 ч роста при сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, запах характерный.

Рост в жидкой минимальной среде Адамса. Через двое суток роста в условиях аэрирования при 37°С сильное равномерное помутнение, запах характерный.

Рост по уколу в мясо-пептонном агаре хороший по всему укьлу.

Желатину не разжижает. 5 На молоке - хороший рост с коагуляцией молока. Индол - образует. Рост на углеводах: хорошо растет на глюкозе, сахарозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, фруктозе. глицерине, манните. Устойчивость к антибиотикам устойчив к пенициллину. Штамм не патогенен. Содержание плазмиды. В экспоненциальной стадии роста культуры клетк содержат многокопийную плазмиду (молекулярньй вес 5,8 мегадальтон),обес печивающую устойчивость штамма к пенициллину и несущую гены треонинового оперона. Клетки продуцента ВНИИ-генетика 472т выращивают на агаризованной минимальной среде в присутствии пенициллина, а затем суспензией клеток, смытых со скошенного агара, засевают жидкую питательную посевную среду, содержащую источники углерода, азота необходимые минеральные соли, мел, пеницщтин и питательную добавку в виде гидролизатов белок-содержащих субстратов. Посевной материал выращи вают в колбах на качалке или в ферментерах при непрерывном аэрировании и перемешивании при температуре 3537°С в течение 20-30 ч. Выращенный посевной материал вносят в ферментационную среду, содержа щую источники углерода, азота и необ ходимые минеральные соли. В качестве источников углерода применяют сахаро зу глюкозу технический сахар, мелас су. Ферментацию продуцента треонина осуществляют на ферментерах, оснащен ных системой РН-статирования, при непрерывном аэрировании и перемешива нии при температуре . В качестве титрующего агента применяют аммиачную воду, либо сбаланси рованную (по углероду и азоту) подпитку. Продолжительность культивирования 30-55 ч. К концу ферментации в культуральной жидкости накапливает ся до 32 г/л 1-треонина. Выделение L-треонина осуществляют одним из известных способов. П р и м е р 1. Культуру продуцент E.coli ВНИИгенётика 472Т, выращенную на агаризованной минимальной среде с глюкозой в присутствии пенициллина пересевали на жидкую посевную питательную среду следующего состава, %: Сахароза4 Сульфат аммония 1 Калий фосфорнокислый 0,2 Двузамещенный магний сернокислый0,04 Гидролизат белоксодержащего субстрата 0,5 Пенициллин0,5 г/л Мел1 Выращивание посевного материала проводили в колбах Эрленнейера емкостью 750 мл (объем среды - 100 мл) на качалке (240 об/мин) при температуре 35-37°С. Продолжительность выращивания посевного материала 20 ч. Полученным посевным материалом засевали ферментационную среду (в количестве 5% от объема среды) следующего состава, %: Глюкоза2 Сульфат аммония 1 Калий фосфорнокислый О,2 Двузамещенный магний сернокислый0,04 Ферментацию проводили в ферментере с рабочим объемом 0,5 л, оборудованном системой РН-статирования. Режим ферментации: расход воздуха 0,5 л/мин, перемешивание 900 об/мин РН-{хтатирование на уровне 7,0-7,2 за счет подачи щелочного титрующего агента, подпитки, имеющей состав: Аммиачная вода 25%-ная, мл . 25 Глюкоза, г60 Вода водопроводная, мл150 Ферментацию вели при температуре З7с. Через 36 ч культивирования накопление L-треонина в культуральной жидкости составило 20 г/л; расход глюкозы на 1 г треонина 4,5 г. П р и м е р 2. Продуцент L-треонина и условия выращивания посевного материала те же, что и в примере 1, за исключением содержания гидролизата белоксодержащего субстрата, который был использован в количестве 0,2%. Через 28 ч выращивания посевной мате-г риал (в количестве 10% от объема среды) ввели в ферментационную питательную среду, имеющую состав, %: СахарозаВ Сульфат аммония . 1 Калий фосфорнокислый Двузамещенный магний сернокислый0,04 90 Ферментацию проводили в ферментере с рабочим объемом 0,5 л, оборудованном системой РН-статирования. Условия культивирования продуцента треонина те же, что и в примере 1. Для поддержания РН на уровне 7,0-7,2 использовали водный раствор аммиака с концент рацией 3%. В ходе ферментации по мере снижения концентрации сахарозы в куль туральной среде в ферментер дробно вводили 402-ный раствор сахарозы. Через 54 ч культивирования в культуральной жидкости накопилось 32 г/л L-треонина, расход сахарозы составил 4 г на 1 г треонина. П р и м е р 3. Продуцент L-треонина и условия выращивания посевного материала те же, что и в примере 1. Выращенный посевной материал вводили в ферментационную питательную среду, имеющую тот же состав, что и в примере 2. Отличие от щжмера 2 состояло в использовании мелассы в количестве 16% (по техническому весу), вме8вместо сахарозы. Условия культивирования продуцента L-треонина и методика РН-статирования те же, что и в примере 2. Через 29 ч ферментации в культу -, ральной среде накопилось 16 г/л Lтреонина, расход сахара на 1 г треонина составил 4,8 г. Как видно из примеров, предлагаемый способ получения L-треонина позволяет использовать в качестве источника углерода доступные технические источники углеводов, при одновременном снижении расхода углеводов в 1,2-1,5 раза по сравнению с известным способом. Кроме того, расход гидролизата белоксодержащих субстратов и пенициллина снижается в 10 раз, При этом, благодаря снижению содержания посторонних примесей, облегчается процесс вьщеления L-треонина из культуральной жидкости.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА, предусматривающий проведение операций приготовления посевного материала путем выращивания процудентов треонинабактерии Escherchia coli в посевной питательной среде, введения посевного материала в ферментационную питательную среду, содержащую источники углерода, азота и минеральные соли, добавления гидролизата белоксодержащего субстрата и последующую ферментацию в глубинных условиях, отличающийся тем, что, с целью расширения сырьевой базы, а также удешевлен ния способа, в качестве продуцентов треонина используют штамм Escherchia coll (ВНИИгенетика - 472Т), при этом выращивание продуцентов ведут в жидкой посевной среде, а добавление гидролизата белоксодержащего субстрата осуществляют непосредственно в посевс Ф ную питательную среду.