Способ выделения иммуноглобулина G из сыворотки крови кур Советский патент 1991 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к иммунохимии птиц, и может быть использовано в сывороточном производстве для выделения высокоактивного специфического иммуноглобулина класса G (IgG) из сыворотки крови кур с целью дальнейшего его использования в иимунохимических методах.

Известны способы выделения IgG из сывороток крови животных- высаливание сульфатом, риваноловый способ, осаждение этанолом, осаждение полиэтиленгликолем (ПЭГ)и гель-фильтрация.Однако эти способы характеризуются рядом недостатков: большими потерями IgG при очистке (хроматография), наличием примесных белков

(осаждение этанолом, высаливание сульфатом аммония, риваноловый способ, гель- фильтрация); значительным снижением антительной активности выделенного по сравнению с исходным материалом (хроматография, осаждение этанолом) трудоемкостью и низкой производительностью (хроматография, риваноловый способ)

Прототипом является способ выделения иммуноглобулина класса G из сыворотки крови кур, предусматривающий фракционное осаждение глобулинов сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией Однако способ многостадиен, малопроизводитепсн п сопровождается значительными потерями

ON Ю СЛ Ю W

белками снижением антительной активности.

Цель изобретения - повышение выхода иммуноглобулина класса G из сыворотки крови кур и его антительной активности.

Поставленная цель достигается тем, что. для получения иммуноглобулина класса G, осаждение иммуноглобулинов ПЭГом- 6000 проводят дважды, первый раз при концентрации 13%, а второй раз при концентрации ПЭГа-6000 10% при рН 4,4- 4,6 с последующим подтитровыванием над- осадка до рН 6,6-5,8.

Пример 1.На первом этапе сыворотку крови кур разводят 1:1 (по объему) 0,05 М фосфатно-солевым буфером (ФС,Б) с рН 7,8- 8,0 и инкубируют 16-18 ч при 4-6 С. Осадок удаляют центрифугированием при 5000 об./мин в течение 30 мин. К полученному надосадку капельно при постоянном поме- шивании на холоде добавляют 50%-ный (вес/объем) раствор ПЭГа-6000 до конечной концентрации в растворе .13%. Смесь инкубируют 1,5-2,0 ч при 4-6°С. После этогос раствор центрифугируют при 5000 об./мин в течение 30 мин. Супернатант сливают, а осадок ресуспендируют 0,05 М натрийаце- татным буфером с рН 4,4-4,6 до объема, равного двум объемам сыворотки. Затем капельно, при постоянном помешивании, до- бавляют 50%-ный раствор ПЭГа-6000 до конечной концентрации в растворе 10%. Полученную смесь инкубируют 1,5-2,0 ч при 4-6 С. Раствор центрифугируют при 5000 об./мин в течение 30 мин. Супернатант ели- вают в отдельную посуду и подтитровывают 1 N раствором NaOH до рН 5,6-5,8. Раствор инкубируют 1,5-2,0 ч при 4-6° С. После этого раствор центрифугируют при 5000 об./мин в течение 40 мин. Осадок растворя- ют в минимальном объеме 0,01 М ФСБ рН 7,2-7,4 и диализуют против 200-кратного объема этого же буфера в течение 48 ч при 4-6° С.

Выделение иммуноглобулина класса G проводят описанным способом. Параллельно IgG выделяют ПЭГом-6000, ионнообмен- ной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, гель-фильтрацией на сефадексе G-200, высаливанием сульфатом аммония, риваноловым способом л осаждением этанолом.

Для проведения опытов берут гипе- риммунную куриную сыворотку к вирусу бо - лезни Гамборо. Иммуноглобулины выделяли из 10 мл гипериммунной курино сыворотки, а объем выделенного иммуноглобулина доводили до 5 мл.

Чистоту выделенных иммуноглобулинов контролировали в иммуноэлектрофорезе с кроличьей антикуриной сывороткой. Иммуноглобулины, выделенные двукратным осаждением ПЭГом-6000 с последующим подтитровыванием, ионнообменной хроматографией и этанолом, образовали одну линию преципитации, соответствующую фракции IgG. Иммуноглобулины, выделенные другими способами, образовывали две и более линий преципитации, что свидетельствует о наличии примесных белков,

Наивысший выход белка (9,82%) установлен при выделении иммуноглобулинов высаливанием сульфатом аммония. Однако это обусловлено наличием в выделенной фракции иммуноглобулинов примесных белков. Наименьший выход белка (5,71%) отмечен в ионнообменной хроматографим (таблица), Это обусловлено потерями иммуноглобулина.

Чистоту выделенных фракций IgG контролировали в иммуноэлектрофорезе и препаративномэлектрофорезевполиакриламидном геле (ПААГ). На иммуно- электрофореграмме видна одна полоса преципитации, соответствующая фракции IgG кур. Столбик ПААГ после электрофореза окрашен в зоне фракции IgG.

Специфическую активность выделенных иммуноглобулинов определяли в реакции диффузной преципитации (РДП) и в ИФА. Титр иммуноглобулинов, выделенных различными способами, колебался от 1:64 до 1:256 (таблица). С целью объективной оценки чистоты выделенного IgG и сохранения его антительной активности определяли удельную активность (титр 1 мг белка) в РДП и ИФА. Наивысшую удельную активность имели иммуноглобулины, выделенные двукратным осаждением ПЭГом-6000, причем активность их превышала в 2-4 раза титр иммуноглобулинов, выделенных другими способами.

В дальнейшем, иммуноглобулины, выделенные из иммунной сыворотки к вирусу болезни Гамборо, использовали для получения иммунопероксидазных конъюгатов с по- следующим применением в ИФА для индикации антигена вируса болезни Гамборо. При этом наивысшую активность имел конъюгат пероксидазы с IgG, выделенный двукратным осаждением ПЭГом-6000 Результаты описанных данных представлены в таблице.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что двукратное осаждение ПЭГом- 6000 с последующим подтитровыванием надосадка до рН 5,6-5,8 пригодно для выделения иммуноглобулинов класса G из сыво ротки крови кур

Предлагаемый способ дает возможность увеличить выход иммуноглобулинов класса G со значительной степенью очистки при наименьших потерях с сохранением антительной активности выделенных IgG. Формула изобретения Способ выделения иммуноглобулина G из сыворотки крови кур, включающий кратную обработку сыворотки осаждающим агентом в понижающейся концентрации, отделение осадка, растворение его в буферном растворе и очистку осадка, содержаще- го целевой продукт, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целе

вого продукта и его антительной активности, обработку проводят двукратно, в качестве осаждающего агента используют полиэтиленгликоль мол.м. 6000, при этом при первой обработке полиэтиленгликоль вводят до конечной концентрации 13 мас.% на объем раствора, полученный осадок растворяют при рН 4,4-4,6, повторно обрабатывают полиэтилен гликолем при конечной концентрации 10 мас.% на объем раствора, отделяют жидкую фазу, доводят рН ее до 5,6 - 58 и отделяют осадок, содержащий целевой продукт.

Изобретение относится к технологии получения иммуноглобулина класса G. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и его антительной активности Поставленная цель достигается тем, что для получения иммуноглобулина класса G осаждение иммуноглобулинов ПЭГом - 6000 проводят дважды, первый раз при концентрации ПЭГ 13%, а второй раз при концентрации ПЭГ 10%. рН 44-46 с последующим подтитровыванием насадка до рН 5,6-5,8 1 табл СО