Способ титрования вируса иммунодифицита человека Советский патент 1991 года по МПК C12N7/00 C12N5/00 

Изобретение относится к вирусологии.

Целью изобретения является упрощение способа титрования вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

П р и м е р 1. Культивирование диплоидных клеток эмбриона человека штамма Л-68 проводят по известной методике. На монослой ДКЧ, выращенный в чашках Петри размером 36x10 мм, наносят взвесь лимфоидных клеток линии МТ-4 в количестве 1,5х106 кл/мл, чувствительные к цитола- тическому действию ВИЧ. В культуру добавляют среду следующего состава: среда RPMM640, 10% сыворотки плодов коровы, 0,06% глутамина и 50 мкг/мл гектамицина. Чашки с культурой помещают в термостат с 5% СО при 37°С. На следующий день питательную среду удаляют, культуру просматривают под микроскопом и отбирают ту, где образовался монослой лимфоидных клеток,

На прикрепившихся лимфоидных клетках проводят титрование вируса, используя на каждое разведение по две чашки. Культуру оставляют для адсорбции вируса на 1 ч при 37°С в термостате с 5% СОа. Затем жидкость удаляют, клетки промывают средой RPMl-1640 и заливают питательную среду RPMI-1640 с 20% сыворотки плодов коровы, 0,06% глутамина, 50 мкг/мл гектамицина и среду Игла в равных объемах. Культивирование проводят в термостате при 37°С с 5% С02. На 6-е сутки питательная среда удаляется и на монослой клеток наносится 0,1%-ный раствор нейтрального красного в количестве 1-2 мл. Чашки с культурой помещают в термостат на 30 мин при 37°С, а затем их просматривают и подсчитывают образовавшиеся бляшки просветления на окрашенном в розовый цвет фоне.

Оч

О

к

2

В табл. 1 представлен протокол титрования ВИЧ трех штаммов на монослойной культуре лимфобластов.

П р и м е р 2. Лимфоидные клетки наносят на монослой ДКЧ линии Л-65 или Л-68. Остальные процедуры проводят аналогично примеру 1. В табл. № 2 приводятся данные сравнительного титрования ВИЧ на лимфо- идных клетках, прикрепленных на монослое ДКЧ, и на монослое, сформированном с по- мощью поли-Ышзина.

Из табл. 2 видно, что качество моно- слойных лимфоидных культур, сформированных на основе ДКЧ с помощью поли-Ь-лизина, равноценно.

П р и м е р 3. Лимфоидные клетки культивируют совместно с диплоидными клетка- ми человека для последующего инфицирования ВИЧ. Обоснование концентраций лимфоидных клеток представлено в табл. 3.

Как видно из табл. 3, наиболее эффективная концентрация клеток 1,5-2x10 /мл. Кроме того, табл. 3 позволяет установить, что оптимальным сроком сокультивирова- ния лимфоидных и диплоидных клеток является 24-48 ч. Сохранение монослоя на более поздних сроках может ухудшить условия репродукции ВИЧ до образования бляшек. Кроме того, культивирование клеток свыше 48 ч не оправдано экономически (дополнительная смена культу рал ьной среды, использование дорогостоящих антибиотиков и др.).

П р и м е р 4. Для выбора оптимальных сроков учета бляшкообразования ВИЧ в культуре клеток проводят ряд экспериментов, усредненные результаты которых представлены в табл. 4 (концентрация 1,5- 2х10в кл/мл).,

Из табл. 4 видно, что оптимальным сроком для учета результатов титрования ВИЧ являются 5-7-е сутки, так как на более ранних сроках бляшки не образуются, а начиная с 8-х суток идет лизис культуры клеток.

Формула изобретения Способ титрования вируса иммунодефицита человека, включающий создание чувствительной клеточной системы, ее заражение вирусом иммунодефицита человека с последующим определением титра вируса, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, создание чувствительной клеточной системы осуществляют путем культивирования диплоидных клеток человека до стадии монослоя с последующим нанесением на монослой взвеси лимфоидных клеток в концентрации 1,5-2x106 клеток в 1 мл, а определение титра вируса осуществляют путем подсчета бляшек на 5-7-е сутки после заражения,

Т а б л и ц а 1

Изобретение относится к вирусологии. Целью изобретения является упрощение способа титрования вируса иммунодефицита человека. Указанная цель достигается тем, что проводят заражение вирусом иммунодефицита человека клеточной системы. При этом клеточную систему создают путем культивирования диплоидных клеток человека до стадии монослоя, после чего на него наносят взвесь лимфоидных клеток в концентрации 1,5-2,Ох106 клеток в 1 мл, Титр вируса определяют путем подсчета бляшек на 5-7-е сутки после заражения. 4 табл.

прикрепленные поли- -1-лизином

Лимфоидные клетки на монослое ДКЧ-А-65

ДКЧ-Л-68

Таблица2

16

17

1,6x10 1,7x106

ТаблицаЗ

НМШ « « - вв вивввмивввввишвв вввврив в

КоличествоДанные при времени культивирования, ч

тифоидных

клеток на 10 2k ЦВ 72 I, 96 монослой, кл/мл

0,5-0,7x10 Монослоя нет Монослоя нет Монослоя нет Монослоя нет Монослоя нет 1,5-2x10 То. же Монослой Монослой Монослой Монослой

3-5x10 Очень густойОчень густойКлетки отпа- Монослой Монослоя нет слой,многослой, многодают, нару- нарушен плавающихплавающихшается моноклетокклетокслой

- - --«MMMWHMW- -« ..«|. (,,.

Таблица

Время куль- Наличие тивирования, бляшек сут.

3 k

5+

6+

7+

8Лизис клетки