Штамм культивируемых клеток кожи и мышц эмбриона африканской зеленой мартышки для размножения вирусов Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области вирусологии, биотехнологии, и касается получения нового клеточного штамма из кожи и мышц эмбриона зеленой мартышки 4921, изучения его свойств, аттестации в качестве безопасного клеточного субстрата и оценки пригодности для применения в вирусологической практике, в том числе и в вакцинном производстве.

Цель изобретения - установление нового отечественного штамма перевийаемых клеток кожи и мышц эмбриона Африканской зеленой мартышки с неограниченным количеством субкучьти- йирований - удобной и доступной лабораторной модели, пригодной как для вакцинного производства, так и для научно-исследовательской работ

Проведена криоконсервация штамма на различных уровнях пассажей: & жидком азоте хранится более 6 млрд (слеток. Штамм 4921 хранится во Всесоюзной специализированной коллект (елеточных культур Института медици г ежой генетики АМН СССР на уровне 42 пассажа (10 пассаж после трансфорнь ции), ему присвоен регистрационный номер 11-0(15/3/9). Из эмбриона африканской зеленой мартышки, зарегистрированной в виварии под № 4321, попу чено два вида культур - штамм дипло f ных клеток„ обозначенный 4921D и штамм гетероплоидных клеток - 4921. , Проведена криоконсервация штамма 4921D на ранних уровнях пассажей: в Жидком азоте находится более 4 млрд. клеток. Штамм 4921D хранится во Все Союзной Специализированной коллекции неточных культур Института медицин- Јкой генетики АМН СССР на уровне 9 пассажа, ему присвоен регистрационный номер 12-D(15/3/9)

Штамм 4921 получают следующим образом. Первичную культуру готовят из ; мбриона африканской зеленой мартышки (cercophithecus aethiops), выделенного путем кесарева сечения в кпинике рбезьяноИПВЭ АМН СССР, Обезьяна 4921 прошла 45-дневный карантин и была клинически здорова,,

Дискретные клетки получают с п.ло- щыо метода щадящей тринсинизации лл- мельченных кусочков кожи и мышц эмбриона 0„25%-ным раствором трипсина при чередующихся контактах с питательнрй средой. Клетки ресуспендируют в среде Игла MEM с 10%| сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) и эксплантируют в два полуторалитровых матраса с концентрацией клеток 12«10V ui. Сосуды с клетками инкубируют при 37°С. В первичной культуре монослой формируется на сутки о В зависимости от срока формирования монослоя проводится первое субкультивирование, а все последующие - по четкому графику: два раза в неделю, так что интервал между перевивками клеток постоянно

S

составляет 3-4 суток. Используют соеду того не состава,

Отделение клеток от стекла осуществляют 0 ,25%-ным раст вором трипсина. Криоконсервируют клетки с использованием 10Ј глицерина, 15% СКРС и 15% среды роста. При восстановлении после замораживания используют среду роста. Жизнеспособность клеток колеблется от 51 до 89%.

Культуральные свойства. Штамм 492ID характеризируется следующими признаками. Жизненный цикл диплоидного штамма составляет пассажей. Фазы роста: становлениь - 1-3 пассаж, активный рост - 3-30 пассаж, старение - 30-50 пассаж. Кратность рассева в первых двух фазах 1:3 реже 1:2, в третьей - 1:1,5, 1:1. Посевная доза 100-120«103 в 1 мл. Среднее чиспо число популяционных удвоений 50, среднее время удвоения популяции 60 ч. В фазе старения .эти показатели составляют 10 и 73 соответственно. При изучении видовой, принадлежности показано, что изофер- менты лактатдегидрогеназа и глкжозо- б-фосфат дегидрогеназа - энзимограм- мы обезьян.

Морфологические признаки. В первичной культуре монослой состоит из фибробластоподобных клеток с примесью эпителиоподобных клеток. По мере культивирования количество последних уменьшается, но полностью они никогда не исчезают, 8 фазе активного роста преобладают фибробластоподобные клетки, в некоторых пассажах культура кажется мономорфной.

Кариологическая характеристика. Кармологический анализ проводят на „ровне 12S 19, 28, 57 пассажей по 1000 метафаз. Кариотип 2п - 60, XX. Число клеток с отклонениями в наборе хромосом колеблется в пределах и в число диплоидных клеток входят метафазы с пробелами и разрывами, но с числом хромосом 60„

Контроль штамма 4921D на посторонние контаминаиты. На уровнях 10, 14, 24 и 37 пассажей клетки штамма 492ID и собранную с них культуральную жидкость испытывают на безопасность. В опытах на животных и чувствительных (снеточных системах, а также методом электронной микроскопии посторонних агентов не обнаружено. Тесты йа онко- генность на уровне 10, 20, 31, 43

пассажей, проведенные на линейных мышах СВА, отрицательны.

Клетки штамма 492ID чувствительны к заражению вакцинными штаммами Сэ- бина вируса полиомиелита, титры которых составили 7,21 lg БОЕ/мл для I типа; 6,50 - для II типа и -7,64 для III типа. После длительного хранения в жидком азоте клеток штамма 4921D на уровне 32 пассажа получен штамм гетероплоидных клеток 4921 с высокой пролиферативной активностью.

Штамм 4921 характеризируется следующими свойствами.

Культуральные свойства. После восстановления клеток штамма 4921D на уровне 32 пассажа монослой сформируется за 5 суток. После перевивки с кратностью рассева 1:2 монослой образуется уже за 1 сутки. Отмечено, что на уровне 34 пассажа мочослой состоит из мелких фибробластоподоб- ных клеток, которые не встречаются в культуре 492ID. В процессе становления штамма 4921 регистрируют увеличение числа эпителиоподобных клеток, но, начиная с 39 пассажа, в культуре преобладают фибробластоподобные клетки. При кратности рассева 1:3 монослой формируется за сутки, а после его уплотнения на 3 сутки в 1,5 л матрасной колбе на уровне 38 и 39 пассажей содержится 97 и 90 х 10 клеток соответственно.

В одной серии опытов проводят 112 последовательных пассажей. При этом культура в основном состоит из фибро- бластоподобных клеток, но при изменении условий культивирования - смена серий сывороток и среды вызывает изменение внешнего вида культуры. Например, на уровне 59,84 и 90 пассажей количество эпителиоподобных клеток в монослое значительно увеличивается. На 113 пассаже культура помещена в жидкий азот при сохранении высокой пролиферативной активности клеток. Последняя в 2-3 раза выше, чем у клеток штамма 4921D.

Для перевивок применяют среду Игла MEM с 10% СКРС. В качестве крио- протектора используют 10% глицерина, клетки ресуслендируют в среде Игла MEM содержащей 10% СКРС, с концентрацией 4 10е/мл. Жизнеспособность клеток составляет 82+5%.

Морфологические признаки. Штамм 4921 изучают с использованием цито,

5834406

логических методов на уровнях 51, 59 и 102 пассажей. Для характеристики динамики формирования монослол окрашенные гематоксилином и эозином

5 препараты фиксируют на 1, 2 и 3 сутки после посадки клеток.

Характер роста, форма клеток и ядер отличаются от морфологии диJQ плоидных клеток штамма 4921D; представленных в основном веретеновидны- ми фибробластоподобными клетками с удлиненными ядрами.

На первые сутки роста в культуре

15 51 пассажа наряду с фиброблзстоподоб- | ными клетками присутствуют s значительном количестве эпителиоидные клетки с округлыми ядрами и пластин- чатой цитоплазмой. На 2-3 сутки 51,

20 а также 59 и 102 пассажей эпителио- подобные клетки преобладают. Наблюдается их значительный полиморфизм. Культура состоит из эпителиоидных полигональных клеток, отличающихся

25 по форме и величине. Полиморфизм

увеличивается с пассажами, что характерно для трансформированных культур.

Цитоплазма эпителиоидных клеток всех уровней пассажей имеет пластинЗо чатый характер, ядра округлые преимущественно с 1-2 ядрышками. На разных участках препаратов встречаются клетки с увеличенными ядрами, а также клетки с 2-3 и большим числом ядер (1-5%). Среди митозов имеются аномальные деления (многополюсные), с неправильным расположением и расхождением хромосом, местами неравномерным делением ядер. Внутриядерных и

.Q цитоплазматических включений, вакуолизации и других признаков контаминации клеток не обнаружено.

Кариологическая характеристика. При кариологическом изучении штамма

д5 4921 на уровне 43 и 56 пассажей установлено, что штамм - гетероплоидный. Число хромосом колеблется от 57 до 63. Модальный класс - с 61 хромосомой.

Контроль штамма 4921 на посторонние контаминанты. При обследовании клеток штамма 4921 на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) были получены отрицательные результаты на уровнях 34-112 пассажей.

При исследовании культуральных жидкостей и самих клеток на уровнях 39, 51, 72, 104 пассажей в чувствительных клеточных системах - в пер50

55

7

вичной культуре клеток почек африканских зеленых мартышек, в двух штамма диплоидных клеток эмбриона человека и первичной культуре клеток почек кролика, а также в реакции гемадсорб ции с эритроцитами морской свинки вирусы-контаминанты не выявлены.

При обследовании клеток штамма 4921 на тех же уровнях пассажей в опытах на новорожденных и взрослых белых мышах, кроликах, морских свинках, на куриных эмбрионах и иммуно- депрессированных мышах линии СВА посторонних агентов, в том числе онко- генных, не обнаружено.

Чувствительность к вирусам. Определена чувствительность штамма 4921 к заражению энтеровирусами человека. К первичному заражению без адаптации культура чувствительна к вакцинному штамму Сэбина трех типов вируса полиомиелита, Коксака А-7, Э, 14, 16.

П р и м е р 1. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина тип I.

В матрасную колбу вместимостью 1,5 л с монослоем клеток штамма 4921 на уровне 39 пассажа вносят подогретую до 37°С смесь 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора версена в равных объемах (общее количество 20 мл). Монослой ополаскивают несколько раз, жидкость удаляют а культуру помещают в термостат при 37°С на 2-3 мин. Затем колбу встряхивают до полного отделения клеток и вносят 500 мл среды роста, клеточную взвесь энергично встряхивают и разливают в 20 флаконов вместимостью 100 мл по 25 мл в каждый В качестве среды роста используют среду Игла МЈ с 10% CKPC. Культуру инкубируют при 37°С в течение 3 суток до момента формирования монослоя.

При заражении питательную среду удаляют, клеточный слой однократно промывают рабочим раствором Эрла и вирус полиомиелита вносят в разведении 10-з с 15 мл среды ГЛАЭМ (0,52 гидролизата лактальбумина на растворе Эрла с равным количеством среды Игла). Инфицированные культуры инкубируют при . Учет результатов проводят, начиная с 2 суток после заражения. Титр вируса полиомиелита штамм Сэбина I типа был равен - 7,49 lg БОЕ/мл.

8

П р и м е р 2. Способ культивирования вируса полиомиелита штамм Сэбина II типа.

Культуру клеток штамма 4921 на уровне 40 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 1, при этом титр вируса составил 7,55 lg БОЕ/мл.

5

0

5

5

0

5

ПримерЗ. Способ культивирования вируса полиомиелита штамм Сэ- бина III типа.i

Культуру клеток штамма 4921 на уровне 40 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному Е примере 1, при этом титр вируса составил 7,66 lg БОЕ/мл.

П р и м е р 4. Способ культивирования вируса Коксаки А-7.

В матрасную колбу вместимостью 1,5 л с монослоем клеток штамма 4921 на уровне 55 пассажа вносят подогретый до 37° С 0,25%-ный раствор трипсина в объеме 20 мл. Монослой ополаскивают несколько раз, жидкость удаляют, а колбу помещают на аналогичный сосуд, заполненный подогретой до 38°С водой. Через 2-3 мин колбу энергично встряхивают до полного отделения клеток от стекла и вносят 400 мл среды роста. Клеточную взвесь энергично встряхивают и разливают на 200 пробирок по 2 мл в каждую. В качестве среды роста используют среду Игла MEM с 10% СКРС. Культуру инкубируют при 37°С в течение 2 суток до момента формирования монослоя.

При заражении питательную среду удаляют, клеточный слой однократно промывают рабочим раствором Эрла, и вирус вносят в соответствующем разведении на растворе Эрла по 0,2 мл. Время адсорбции 40 мин при комнатной температуре . Затем вносят 1,8 мл среды ГЛАЗИ. Инфицированную культуру инкубируют при 37°С, Учет результата проводят, начиная с 3 суток после заражения. Титр вируса Коксаки А-7 равен &,70 lg ТЦДгв/мл.

П р и м е р 5. Способ культивирования вируса Коксаки А-9.

Культуру клеток штамма 4921 на уровне 55 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 4, при этом титр вируса , составляет 8,70 lg ТЦ%в/мл.

П р и м е р 6 Способ кульТивиро- вания вируса Коксаки А-14,

91583МОio

Культуру клеток штамма 921 на Таким обоазом, предлагаемая «спе- уровне 55 пассажа получают и заража- точная система 4921 представляет ноют вирусом по способу, описанному ввый отечественный штамм гетероплоид- примере Ц, при этом титр вируса сое-ных перевиваемых клеток кожи и мышц тавляет 8,36 lg . эмбриона африканской зеленой мартышПример. Способ культивиро-ки. вания вируса Коксаки А-16.

Культуру клеток штамма 921 наФормула изобретения уровне 55 пассажа получают и заража- JQ Штамм культивируемых клеток кожи

ют вирусом по способу, описанному ви мышц эмбриона африканской зеленой

примере 4, при этом титр вируса сое-мартышки BCKK-D № 11D (15/3/9) для

тавляет 7,70 lg .размножения вирусов.

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии и касается получения нового штамма гетероплоидных клеток из кожи и мышц эмбриона зеленой мартышки 4921, изучение его свойств, аттестации в качестве безопасного клеточного субстрата и оценки пригодности для применения в вирусологической практике, в том числе и вакцинном производстве. Цель изобретения - установление нового отечественного штамма перевиваемых клеток кожи и мышц эмбриона африканской зеленой мартышки с неограниченым количеством субкультивирований. Штамм 4921 установлен из штамма диплоидных клеток 4921Д. В качестве среды роста применена среда Игла МЕМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Штамм 4921 гетероплоидный обладает устойчивыми биологическими и морфологическими свойствами, видовая принадлежность подтверждена кариологическим анализом. Создан банк посевных клеток на уровне 42 пассажа. Он состоит из 286 ампул, содержащих 6 .10 6 клеток в каждой, и отконтролирован на безопасность. Кроме того, имеется 6 млрд.клеток на различных уровнях пассажей, заложенных в крупногабаритные контейнеры. Штамм свободен от посторонних агентов - микробов, грибов, вирусов, микоплазм, не онкогенен. Он удовлетворяет всем требованиям ВОЗ, предъявляемым в вакцинным клеточным субстратам, и пригоден для производства лечебно-диагностических препаратов. Установлена чувствительность штамма 4921 к заражению энтеровирусами человека, титр вируса полиомиелита штамм Сэбина 1 типа 7,49LG,П типа 7,55LG,Ш типа-7,66LG, титры вируса Коксаки А колебалис 6 от 7,7 до 8,7 LG Тцд 050/мл.