ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ЭМБРИОНА ОВЦЫ ДЛЯ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИРУСОВ Советский патент 1994 года по МПК C12N5/06 

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии и касается получения нового клеточного штамма из почек эмбриона овцы 4184, изучения его свойств, аттестации в качестве безопасного клеточного субстрата и оценки пригодности для применения в вирусологической практике.

Цель изобретения - установление нового отечественного штамма гетероплоидных клеток почек эмбриона овцы - удобной и доступной лабораторной модели, пригодной для вирусологической практики.

Установлен новый штамм гетероплоидных клеток почек эмбриона овцы 4184 с использованием доступных питательных сред и недефицитной сыворотки крупного рогатого скота (СКРС).

Штамм 4184 хранится в Специализированной коллекции клеточных культур Института медицинской генетики АМН СССР. Культура депонирована на уровне 97 пассажа с регистрационным номером Д-10 (15/2/7).

Штамм 4184 получают следующим образом.

У эмбриона овцы после снятия шкурки экстирпируют почки и помещают их во флакон со стерильной питательной средой - смесь 0,3%-ного гидролизата лактальбумина и среды Игла на растворе Хенкса в равных объемах, рН 7,0 (ГЛАХИ) с 10% СКРС. Почки в питательной среде сохраняют при 4-8^оС. Через 12 ч почки подвергают щадящей трипсинизации с использованием 0,1%-ного раствора трипсина. Полученные дискретные клетки эксплантируют в 1,5 л матрасные колбы и инкубируют при 37^оС в стационарном положении. В качестве среды роста используют среду ГЛАХИ с 10% СКРС. На 7 сутки после образования монослоя проводят первое субкультивирование с кратностью рассева 1:2. Последующие пассажи через 3-4 суток на среде того же состава. Отделение клеток от стекла осуществляют 0,25% -ным раствором трипсина. Криоконсервируют клетки с использованием 10% глицерина, 10% СКРС и 80% ГЛАХИ.

До 21 пассажа одна из отвивок сохраняет диплоидный набор хромосом и обозначается как штамм 41. Штамм 41 хранится во Всесоюзной специализированной коллекции клеточных культур Института медицинской генетики АМН СССР, депонирован на уровне 9 пассажа. При восстановлении ее на уровне 21 пассажа после длительного хранения в жидком азоте получают культуру с более высокой пролиферативной активностью и гетероплоидным кариотипом - она названа 4184.

Штамм 4184 характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства. После восстановления клеток штамм 41 на уровне 21 пассажа монослой сформируется за двое суток. После перевивки с кратностью рассева 1: 2 плотный монослой формируется уже через 1 сутки. При этом используют среду роста указанного состава. Для введения культуры в строгий график перевивок - дважды в неделю - снижают процент СКРС до одного. Кратность рассева доводят до 1:10. При этих условиях бурный рост культуры наблюдают до 46 пассажа. В связи со снижением пролиферативной активности процент сыворотки увеличивают до 5. Кратность рассева при этом составляет 1:4. Без снижения пролиферативной активности проведено 128 пассажей (срок наблюдения) и штамм помещен в жидкий азот. Клетки штамма 4184 формируют монослой как при стационарном, так и при роллерном культивировании.

Время удвоения популяции клеток штамма 4184 на уровне 41 пассажа 48 ч, на уровне - 90-96 ч.

Для криоконсервации применяют среду указанного состава при концентрации клеток 2-3 ^. 10⁶ в мл. Жизнеспособность после восстановления оказывается (85,5±5)%.

Изоэнзимный анализ показывает наличие изоферментов, характерных для овец. Контролем служат эритроциты животных этого же вида.

Морфологические признаки. На 11 пассаже культура КПЯ-41 образовывает очень тонкий слой распластанных клеток с плохо выраженными границами. Ядра клеток округлые или овальные, обычно с 1-3 ядрышками и мелкими глыбками хроматина. Более крупные ядра, по-видимому тетраплоидные, составляют всего 0,5-1% . Цитоплазма гомогенна и, вероятно, вследствие сильной утонченности окрашивается слабо. Хорошо выражено митотическая и контактная ингибиция. При полностью сформированном монослое митотически делящиеся клетки составляют всего 0,18±0,05%, что свидетельствует об отсутствии потенции к неупорядоченному росту. Цитохимическими методами установлено обычное содержание и локализация нуклеиновых кислот, в цитоплазме выявлены мелкие глыбки кислой и щелочной фосфатаз, гликогена. Ни одним из использованных методов не обнаружено никаких признаков контаминации клеток.

На 32 пассаже штамм 4184 имеет другие морфологические характеристики. Он состоит из плотного, хорошо окрашивающего монослоя эпителиоидных клеток с четко выраженными границами. Ядра клеток округлые или овальные с крупными глыбками хроматина. В ядрах многих клеток увеличено, по сравнению с 11 пассажем, число ядрышек, 1-3% клеток имеют крупные полиплоидные ядра, встречаются двуядерные клетки. Цитоплазма клеток хорошо окрашивается, содержит глыбки кислой и щелочной фосфатаз, гликогена. Митотическая ингибиция выражена; однако митотически делящиеся клетки при сформированном монослое составляют 0,34±0,04%, что почти вдвое превышает такой же показатель на 11 пассаже. Встречаются единичные патологические митозы (многополюсность, потери хромосом). Признаков многослойного роста не обнаруживают. Цитохимическими методами установлена обычная локализация нуклеиновых кислот, но реакция на РНК и ДНК на этом пассаже протекают более интенсивно по сравнению с 11 пассажем штамма. Никаких морфологических признаков контаминации клеток не обнаружено.

На 104 пассаже штамм сохраняет морфологию, характерную для 32 пассажа. Клеточный монослой состоит из полиморфных эпителиоидных клеток с округлыми или овальными ядрами. Клетки с увеличенными полиплоидными ядрами составляют 0,5-3% , встречаются двухядерные и единичные трех-четырехъядерные клетки. Митотическая активность клеток почти вдвое превышает этот показатель на уровне 11 пассажа и составляет 03,5±0,04%. Цитохимическая характеристика сохраняется. Не обнаружено никаких внутриядерных и цитоплазмических включений, а также округления клеток, образования симпластов, характерных для контаминации культуры посторонними агентами.

Кариологическая характеристика. Кариологический анализ проводят на уровне 24, 33, 43 и 90 пассажей. Всего изучают 400 метафаз - по 100 метафазных пластинок на каждом уровне. Показано, что отличительной чертой данной культуры является наличие у 6% клеток 7 метацентриков, в то время как нормальный кариотип овец характеризуется 6 метацентрическими хромосомами. Количество полиплоидных клеток колеблется от 1 до 3%. Отмечено сравнительно высокое число диплоидных клеток - от 87 до 92%.

При кариологическом изучении штамма диплоидных клеток почек эмбриона овцы КПЯ-41 - источника штамма 4184 устанавливают, что процент диплоидных клеток колеблется от 93 до 96, полиплоидных - 0,4 - 1,2, гипоплоидных - от 2,7 до 5,9. Основным отличием штамма 4184 от штамма КПЯ41 является увеличенное количество гиперплоидных клеток в 8-40 раз.

Контроль штамма 4184 на посторонние контаминанты.

При обследовании клеток штамма 4184 на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) были получены отрицательные результаты на уровнях 28, 30, 31, 36, 39, 42, 45, 57, 64, 68, 72, 78, 84, 86, 92 пассажей.

При исследовании культуральной жидкости и самих клеток на уровнях 37 и 100 пассажей в чувствительных клеточных системах (первичной культуре клеток почек зеленых мартышек, в двух линиях диплоидных клеток эмбрионов человека и первичной культуре клеток почек кролика), а также в реакции гемадсорбции с эритроцитами человека, обезьяны, курицы и морской свинки не выявляют вирусы-контаминанты.

При обследовании штамма 4184 на тех же уровнях пассажей в опытах на взрослых и новорожденных белых мышах, кроликах, морских свинках, куриных эмбрионах посторонних агентов не выявляют. В опытах на иммунодепрессированных мышах линии СВА, а также при изучении инвазивности штамма 4184 с использованием штаммов диплоидных клеток человека онкогенных потенций не выявляют.

При электронно-микроскопическом изучении штамма 4184 на уровне 89 пассажа посторонние агенты также не выявляют.

Проведен контроль на отсутствие агента скрепи в клетках штамма 41 на уровне 2 пассажа. При наличии положительного контроля животные, зараженные испытуемыми клетками, остаются здоровыми около 1 года. По окончании опыта готовят гистологические препараты спинного и головного мозга. В спинном и головном мозге опытных животных отклонений от нормы не обнаруживают. В головном мозге контрольных животных отмечают характерный для скрепи спонгиоз в коре больших полушарий и мозжечке.

Заключение об отсутствии агента скрепи в испытуемом материале делают только при наличии клинических признаков заболевания и гистологических находок в контроле.

Чувствительность к вирусам.

Определена чувствительность штамма 4184 к заражению вирусами чумы плотоядных, кори, японского энцефалита, Коксаки В₁-В₆, в частности титры вирусов Коксаки В различных типов колеблются (в логарифмах) от 5,70 до 7,70 ТЦД₅₀/мл, вируса кори от 4,06 до 5,53, титр вируса японского энцефалита - 9,60 ЛД₅₀/мл, вируса чумы плотоядных 4,15 ТЦД₅₀/мл.

П р и м е р 1. Способ культивирования вируса Коксаки В₁. В матрасную колбу вместимостью 1,5 л с монослоем клеток штамма 4184 на уровне 72 пассажа вносят подогретую до 37^оС смесь 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора версена в равных объемах (общее количество 10 мл). Монослой ополаскивают несколько раз, жидкость удаляют, а культуру помещают в термостат при 37^оС. Затем колбу встряхивают до полного отделения клеток и вносят 500 мл среды роста, клеточную взвесь энергично встряхивают и разливают на 200 пробирок. В качестве среды роста используют среду ГЛАХИ с 5% СКРС. Культуру инкубируют при 37^оС в течение 3 суток до момента формирования монослоя.

При заражении питательную среду удаляют, клеточный слой промывают рабочим раствором Эрла и вносят по 0,2 мл вируса Коксаки В₁ в разведении 10^-3-10^-1, Адсорбцию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего добавляют поддерживающую среду - 0,5%-ный гидролизат лактальбумина на растворе Эрла с равным количеством среды Игла в объеме 1,8 мл. Инфицированные культуры инкубируют при 37^оС. Учет результатов проводят, начиная с 3 суток после заражения по мере появления цитопатических изменений. Титр вируса Коксаки В₁ был равен 7,70 lg TЦД₅₀/мл.

П р и м е р 2. Способ культивирования вируса Коксаки В₂. Культуру клеток штамма 4184 на уровне 72 пассажа получают и заражают по способу, описанному в примере 1. При этом титр вируса составил 7,35 lg ТЦД₅₀/мл.

П р и м е р 3. Способ культивирования вируса Коксаки В₃. Культуру клеток штамма 4184 на уровне 72 пассажа получают и заражают по способу, описанному в примере 1. При этом титр вируса составил 6,17 lg ТЦД₅₀ /мл.

П р и м е р 4. Способ культивирования вируса Коксаки В₅. Культуру клеток штамма 4184 на уровне 72 пассажа получают и заражают по способу, описанному в примере 1. При этом титр вируса составил 6,33 lg ТЦД₅₀/мл.

П р и м е р 5. Способ культивирования вируса Коксаки В₁. Культуру клеток штамма 4184 на уровне 72 пассажа получают и заражают по способу, описанному в примере 1. При этом титр вируса составил 6,20 lg ТЦД₅₀/мл.

П р и м е р 6. Культивирование вируса кори штамма ЭШЧ. Монослой клеток штамма 4184 на уровне 107 пассажа получают по способу, описанному в примере 1, заражают вирусом кори в разведении 10^-1-10^-7. Титр вируса 5,53 lg ТЦД₅₀/мл.

П р и м е р 7. Культивирование вируса чумы плотоядных штамм Рокборн. Культуру клеток штамма 4184 на уровне 107 пассажа получают по способу, описанному в примере 1, и заражают по способу, описанному в примере 6. При этом титр вируса составил 4,15 lg ТЦД₅₀/мл.

П р и м е р 8. Культивирование вируса японского энцефалита. Культуру готовят, как описано в примере 1, но в матрасную колбу вносят 150 мл среды роста. Полученную клеточную взвесь эксплантируют в 1,0 л бутыль, которую помещают в аппарат для роллерного культивирования (12 об./ч). Через 3 суток после формирования монослоя культуру трижды промывают и вносят суспензию мозга мышей, зараженных вирусом японского энцефалита, штамм "Пекин-1". Доза вируса на клетку составляет 5-10 ЛД₅₀. Титр вируса японского энцефалита составил 9,60 х lg ЛД₅₀/мл.

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии и касается получения нового штамма гетероплоидных клеток из почек эмбриона овцы 4184, изучения его свойств, аттестации в качестве безопасного клеточного субстрата и оценки пригодности для применения в вирусологической практике, в том числе и в вакцинном производстве. Цель изобретения - установление нового отечественного штамма гетероплоидных клеток почек эмбриона овцы. Штамм 4184 установлен из штамма диплоидных клеток 41. В качестве среды роста применена смесь 0,3%-ного гидролизата лактальбумина и среды Игла в равных объемах, рН 7,0 с 5% сыворотки крупного рогатого скота. Показано, что штамм 4184 гетероплоидный обладает устойчивыми морфологическими свойствами. Видовая принадлежность штамма подтверждена кариологическим и изоферментным анализами. Создан банк посевных клеток на уровне 45 пассажа. Он состоит из 215 ампул, содержащих 6 10 клеток в каждой. Этот путем улучшения клеток отконтролирован на безопасность. Кроме того имеется 1,5 млрд. клеток на различных уровнях пассажей, заложенных в крупногабаритные контейнеры. Штамм свободен от посторонних агентов - микробов, грибов, микоплазм, вирусов, агента скрепи, не онкогенен. Он удовлетворяет всем требованиям ВОЗ, предъявляемым к вакцинным клеточным субстратам, и пригоден для производства лечебно-диагностических препаратов. Установлена чувствительность штамма 4184 к заражению вирусами чумы плотоядных, кори, японского энцефалита и к различным представителям из группы энтеровирусов человека, в частности титры вируса Коксаки В колебались от 6,2 до 7,7×lgТЦД₅₀ (мл, японского энцефалита - 9,6 lgЛД₅₀) мл .

Штамм культивируемых клеток почки эмбриона овцы ВСКК(Д)N Д-10 (15/2/7) для размножения вирусов.