Способ культивирования вирусов Советский патент 1981 года по МПК C12N7/00 C12R1/91 

Изобретение относится к микробиоло гической про1ЛД1шенн9Рти а именно культивированию вирусов. Известен способ культивирования вирусов путем размножения их на линии диплсэидных клеток 1. Однако, известный способ является малодоступным, кроме того линии клеток высоко чувствительны к определенным питательным средам и сывороткам. Цель изобретения - упрощение спосо ба. Это достигается тем, что вирусы размножают на линии диплодных клеток кожи и NBJBiu эмбриона зеленой мартышки 5018. Полученная линия диплодных клеток кожи и мышц эмбриона зеленой мартишки 5016 имеет следующие биpлoгичecкиe генетические и морфологические характеристики. Культура состоит из фиброблас оподобных клеток. Морфология клеток оста ется стабильной в течение фазы акти4ВГ ного роста. Клетки легко снимаются со стекла раствором трипсина, хорошо растут на среде МЭМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Коэффициент развивки достигает величины 1 : 2, 1:3, 1 4. При субкультивировсшии клетки быстро прикрепляются к стеклу и на 3-4 сутки образуют монослой.; Клетки имеют ограниченное время жизни вне организма, до 57 пассажа, на протяжении фазы активного роста не теряют своих генетических свойств. При кариологическом анализе установлено, что на уровнях 10,20,30 и 40 пассажей модальный класс составляли клетки с диплоидным набором хромосом (2п - 60). Число диплоидных клеток . на протяжении фазы активного роста колебалось от 80,3% до 85,5%, гипоплоидных 3,0 - 4,3, гиперплоидных1,3 - 2,0. Хромосомл обследованных диплоидных клеток не отличались от хромовом, характерных для самца африканской зеленой мартышки. Корреляции между уровнями различных отклонений не отмечено. При сравнении хромосомных наборов на разных уровнях пассажей различий не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии контаминации линии другими клетками. Различий также не выявлено в рисунке дифференцированности хромосом по дпине при окраске по Гимза, что свидетельствует о генетической стабильности культуры.

. Изоферментная характеристика клеток линии в отношении лактадегидрогеназы и глюкозо-б-фосфатдеглдрогеназы подтвердила идентичность их клеткам обезьяны.,

Клетки линии , 5018 не контамированы бактериями, грибами и микроплазмами. Посторонние вирусы не выявлены ни в культуральной жидкости, ни : клетках. Тесты на онкогённость также были отрицательными ,

По мере раз1У1ножения клетки замораживают на различных уровнях пассажей для хранения в жидком азоте, таким образом создают их банк. При восстановлении сохраняют жизнеспособность на 80-85%.

Клетки линии чувствительны к различным вирусам: пзуппы ECHO,полиомиелита, кори, : пенящему и цитомегаловирусу обезьян.Характер цитопатических изменений под действием вируса полиомиелита штаммов Сэбина по морфологии и срокам развития не отличается от наблюдаемого в первичной культуре клеток почек зеленых мартышек, используемых для изготовления вакцины против полиомиелита.

Некоторые вирусы из группы ECHO гтипы 3-6,11,13,15,19,20, симпластробразующий вирус обезьян на клетках линии 5018 размножаются более активно, чем на первичных культур&х клеток почек обезьян, и также с характерным цитопатическим эффектом..

Приводятся примеры культивировани вирусов на линии диплоидных клеток кожи и мышц зеленой мартышки 5018.

П р и м е р 1. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина 1 типа.

В матрасную колбу с диплоидными клетками кожи и мнт.иц эмбриона зеленой мартышки 5018 на уровне 7 пассажа вводят 0,25%-ный раствор трипсина подогретый до З7с . Через 10 с трипсин удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при температуре 37 на 2 мин. Затем отслоившиеся клетки ресуспендируютв среде роста - среду МЁМ.с 10% сыворотки крупного рогатого скота, и разливают на две матрасные колбы. Эти культуры 8 пассажа инкубируют при , в течение 4 суток до момента формирования сплошного слоя.

При заражении вирусом среду из культуральных сосудов сливают , клетки трижды пр01 ывают раствором Эрла и вводят вируссодержащую жидкость из расчета .2 БОЕ на клетку. Затем добавляют -поддерживающую среду, в качестве которой используют среду МЕМ.Инфицкрованные культуры инкубируют при . Сбор вируса производят на 4 день после заражения и определяют ег титр по методу образования бляшек. Титр равен 7,4 БОЕ/мл.

При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян его титр равен .7,5 fg БОЕ/мл.

П р и м е р 2. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэе бина П типа.

Клетки линии 5018 на уровне 8 rfacсажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере I. Титр вируса равен 7,3 Cg БОЕ/мп. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян его титр равен 7,4 Eg БОЕ/МЛ.

Примерз, Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина III типа.

Клетки линии 5018 на уровне 8 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 1.Титр вируса равен 7,2 Cg БОЕ/мл. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян его титр равен 7,5 Eg БОЁ/мл,

П р и м е р 4. Способ культивирования вирусов из группы ECHO.

Клетки линии 5018 получают по ме5 тоду, описанному в примере 1.При заражении вирусами среду из культуральных сосудов сливайт, клетки промывают раствором Эрла и вводят 1 мл неразведенной культуральной жидкости, соб0 ранной после заражения определенным типом вируса первичной культуры кле.ток почек обезьян. Для адсорбции вируса культуры выдерживают при 37°С в течение 1 ч при постоянном покачива. НИИ, после зтого добавляют поддерживающую среду. Культуры инкубируют при до развития цитопатического эффекта. Сбор вируса проводят через 5-7 дней после заражения и определяют его титр.

0Параллельно аналогичным способом

заражают первичную культуру -клеток почек обезьян. Во всех случаях в клетках линии 5018 вирусы из группы ЕСЙО размножаются более активно: для 5 вирусов ECHO 3-5, 11,13 титр составляет по сравнению с ,ЕСНО 6, 19 - 10- и , ECHO 20 10-6,0 и Ю и ТЦД50/МЛ. .

П р и м е р 5. Способ культивирования пенящего вируса обезьян.

Клетки линии 5018 на уровне 15 пассажа отделяют от стекла по методу, описанному в примере 1, и эксплантируют в литровую роллерную бутыль в коf личестве 60-10 клеток. Культуру инкубируют при 37°С,во вращающемся состоянии со скоростью 18 об./ч в течение 24 ч до момента формирования монослоя. При заражении вирусом среду из У культуральннх сосудов сливают, 0 клетки прокывёиот физиологическим раствором и вводят вирус из расчета 10 ТЦДд-о/мл-В объеме 30 мл поддержиВеШЩей среды. Вращательным движением вируссодержащую жидкость равномерно распределяют по монослою. Адсорбцию вируса проводят при ЗТс в течение 1 ч при постоянном вращении. Затем вируссодержащую жидкость удаляют, а в сосуд вносят 100 мл поддерживающей среды с 1 % сыворотки телят. Культуры помещают в барабан и вращают с то ice скоростью при 37° С в течение 4 дней. После этого проводят сбор виру са с последующим титрованием по разв тию цитопатического эффекта. Его тит равен 10 . Параллельно вирусом заражают первичную культуру клеток почек обезьян в матрасной колбе, находящейся в ста ционарном положении. Вирус в ней раз множается до титра 10 ТЦДро/мл,., П р и м е р 6. Способ культивирования цитомегаловируса обезьян. Клетки,линии 5018 на уровне 20 пассажа культивируют по методу, описанному в примере 1. При заражении вирусом среду из культуральных сосудов сливают и вводят неразведенн ую вируссодержащую жидкость, собранную со спонтанно зараженных цитомегаловирусом культур клеток почек эмбриона на зеленой мар тышки, в количестве 1 мл. Адсорбцию вируса проводят при в течение 1 ч. После этого добавляют поддержив ющую среду. Культуры инкубируют при в течение 5 дней. После этого проводят сбор вируса с последующим титрованием по развитию цитопатического эффекта, титр которой равен 10 ТЦД50/МЛ. В первичных культурах клеток почек зеленых мартышек вирус размножается менее активно и достигает титра 10- ТЦД50/МЛ. Предлагаекый способ позволяет уве личить количество субстратов , исполь зуемых для культивирования вирусов. в.частности, применение для культи 1вирования вирусов нового субстрата, обладающего стабильными биологическими, генетическими и морфологическими характеристиками в стадии активного роста, не обладающего онкогенностью, легко культивируемого и являющегося чувствительным вирусам. Линия диплоидных клеток кожи и кьпиц эмбриона зеленой мартышки отличается легкостью получения и субкультивирования. При использовании ростовой среды MEM с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота не требует особых видов питательных сред и дефицитной эмбриональной сыворотки .телят, обладает устойчивыми морфологическими, биологическими игенети-ческими особенностями. Она чувствительна ко многим вирусам, что открывает перспективы широкого использования в вакцинном производстве. Ее клетки хорсяйо сохраняются в жидком азоте. Использование линии в производстве вакцин позволит снизить импорт обезьян и готовить большие партии вакцин на стандартном Клеточном субстрате. Формула изобретения Способ культивирования вирусов путем размножения их на линии диплоидных клеток, отличающийся тем, то, с целью упрощения способа, вирусы размножают на линии диплоидных леток кожи и кышц эмбриона зеленой артышки 5018. Источники информации, ринятые вовнимание при экспертизе 1.Патент США №4040905,кл,195/18 (С 12 К 9/00), 1971.