Штамм культивируемых клеток кожи и мышц эмбриона человека для изготовления диагностических препаратов Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для вирусологических исследований и оценки антивирусного действия химиопрепа- ратов.

Цель изобретения - получение нового штамма культивируемых диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемого дпя изготовления диагностических препаратов и размножения вирусов.

Штамм получают следутоцим образом.

Исходной тканью служат кожно-мы- шечные лоскуты 0-недельного эмбриона человека, выделенного путем аборта от здоровой женщины 30 лет, в анамнезе которой не было онкологических, венерических, генетических заболеваний и врожденных аномалий, а также гепатита и туберкулеза.

Первичную культуру клеток эмбриона человека готовят с помощью метода

1чадя1цей трипсиниэации измельченных кусочков ткани 0,25%-ным раствором трипсина при чередующихся контактах с питательной средой.

Клети ресуспендируют в среде Игла №М с 10% СКРС и эксплантируют 10 по луторалитровьгх матрасов с концентрацией клеток 9 « О /мл. Сосуды с клетками инкубируют при 37 С. В первичной культуре монослой формируется за 9 сут. Затем проводят первое суб- кч льтивирование, а все последующие по четкому графику два раза в неделю так, что интервал между пересевами клеток постоянно составляет 3-4 суТо Используют среду того же состава, Отделение клет.ок от стекла осуществляют 0,25%-ным раствором трипсина при кратковременном контакте их с ферментомс Кратность рассева клеток Б фазе активного роста составляет 1:2 1:3,, Полученный штамм обозначают М-23.

Ш Т амм М-23 хранится во Всесоюзной специализированной коллекции клеточных культур Института медицинской генетики АМН СССР под номером ДЗ (15/2/7).

Штамм М-23 характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства.

Жизненный цикл штамма 55±3 пассажа ,

роста становление 1-2 пас-- caw, активный t: OCT 3-41, старение 4 .- 58 пассажей .,

Кра гнссть ряггева в первых двух -t. i ; 1; реже 1:2, третьей - 1:1, : 1 j на уроянях последующих пассажей 1;1, посевная доза 75-100 10 в i МП среды Игла MEM с 10% СКРС. Отделение клеток от стекла проводят Япт л уром трипсина. Количество клеток в монослое 1,5-литро- вого матраса 35 ч5 мин.

обпадает высокой пролифера- тивной активностью и способен сохраняться на стекле в виде монослоя без cMeHbJ среды не менее 2 кед.

При криоконсервации применяют 80% среды Игла MEM, 10% СКРС, в качестве криопротектора используют 10% глицерина |;ри концентрации клеток 2-3 «IO /мл, Жизнеспособными после восстановления остаются 75±5% клеток

Банк посевных клеток состоит из 200 ампуц, содержащих 0,7 млрд. клеток на уровне 7 пассажа.

Изучение изоферментов в клетках niTaNfMa М-23 выявляет энзимограмму человека и глюкозо-6-фосфатдегидрогенаЗУ медленного типа.

Морфологические признаки. Первичная культура состоит из фибробластоподобных и эпителиоподоб- ных клеток с преобладанием первых.

При вступлении культуры в фазу активного роста эпителиоподобные клетки исчезают и под малым увеличением микроскопа наблюдают мономорфную культуру с характерным для фибробластов

ориентированным расположением клеток Такой вид культура теряет л третьей фазе.

I lTatiM М-23 изучают с помощью цитологических и цитохимических методов

на уровне II и 25 пассажей. На фиксированных и окрашенных гематоксилином и эозином препаратах установлено, что культура образует ровный монс- слой,состоящий из веретенопицных однородных фибробластов, ориентированных в потоки по длинной оси клеток. Ядра клеток удлиненные, овальные, содержащие 1-3 ядрьш;ка и мелкие глыб- ки хроматина.

Вь.сокая митс,тическая активность наблюдается в первые сутки лосле посадки, по мере формирования монослоя количество делящихся клеток снг1Жаетс;я до единичных, что свидетельствует о

выраженной митотической, а также контактной ингибиции„

Многослойнос ти культуры не отмечено, Клетки штамма свободны от онко генной потенции,

На гистохимических препаратах наблюдается обычное содержание ДОК и РНК, Кислая и щелочная фосфотазы присутствуют в виде мелких глыбок, редко разбросанных по цитоплазме, Гликоген обнаруживают также в виде мелких глыбок,

Никаких признаков контаминации .культуры (внутриядерных и цитоплазма- тических включений, вакуолизации, образование симпластов, патологических митозов) не выявлено.

Кариологическая характеристика,

Кариологический анализ проводят

на /ровне 10, 20, 30, 40 пассажей по

1000 метафаз, .

Процент диплоидных клеток колеблется .от 90,2 до 93,2, процент полиплоидных - от 0,6 до 1,9. Послед- кий показатель на ,I ниже допустимо5

го ВОЗ предела для диплоидных клеток человека, используемых для изготовления медицинских вирусных вакцин, в связи с этим штамм может быть применен в вакцинном производстве.

Контроль штамма М-23 на посторонние контаминанты.

При обследовании клеток штамма М-23 на стерильность (наличие грибов, бактерий, микоплазм) получены отрицательные результаты на уровне 1-10 пассажей.

При обследовании культуральной жидкости и самих клеток на уровне 10, 20, 30, 40 пассажей в чувствительных клеточных системах, а также в реакциях гемадсорбции вирусы контаминанты не выявлены,

При обследовании штамма М-23 на уровнях 12, 21, 31, 41 пассажей в опытах на взрослых и новорожденных мьшах, кроликах, морских свинках, куриных эмбрионах, иммунодепрессиро- ванных Mbmiax линии СВА посторонних агентов,-в том числе и онкогенных, не обнаружено. На фиксированных и окрашенных препаратах культуры штамма М-23 патологических изменений не выявлено.

Чувствительность к вирусам,

Штамм М-23 чувствителен к полио- и цитомегаловирусу. Вирусом полиомиелита заражают культуру на уровне 8, 9, 12 пассажей Накопление вируса всех трех типов в высоких титрах зарегистрировано без адаптации. На уровне восьмого пассажа титр вируса I типа - 7,71; II - 7,64, III - 7,87 Аналогичные результаты для девятого пассажа - 7,62; 7,34; 7,96; для двенадцатого пассажа - 7,89; 7,70;. 7,55 Ig БОЕ/МЛ.

Титр штамма Ad-169 цитомегаловиру сов колеблется от 10 до

Штамм М-23 используют в качестве тест-системы для диагностики цитоме- галовирусной инфекции.

Пример . В культуральный сосуд со штаммом М-23 диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека на уровне двадцатого пассажа вводят смесь растворов 0,25% трипсина и 0,02% версена (1:5), подогретого до 37°С. Монослой ополаскивают и жидкость удаляют. Сосуд с культурой оставляют до отслоения клеток от стекла при 37°С. Затем в него вводят среду роста (Игла MEM) с 10% СКРС

706

ло концентрации I 20 Ч О VMH йтпесь п объеме 1 мл вносят в пробирки со стеклом. Клетки инокулируюг в стате при (, в Т , ут до фор.чиронания М(л;опо 1.

Удаляют ростовун) срепу и в четыре пробирки с клетками нногят пробы мочи больного с подотрением на цитомегаловирусную инфекцию Ггю О,2 мл

в каждую). Через 40 мин после контакта культуры трижды проминают питательной средой н добавляют пов,тер- живающую среду. В течение 10 дней

культуру ежедневно микроскопируют. На седьмой день регистрируют специфические изменения клеток, выражаю- гциеся в их округлении и изменении структуры .ядер. На восьмой день культуры двух пробирок фиксируют и окрашивают дпя цитологического анализа, а. клетки двух других пробирок отделяют от стекла и взвешипагот р 2 мл среды. Полученную клеточную взвесь вводят

в четыре пробирки с монослойной культурой .штамма М-23, по 0,3 мл в каждую. Контакт с зараженными клетками продолжается iO ми:-;. Вс остальные процедуры проводят аналогично

описанному. Для ппделеиия вируса требуется пять сокультквир лрaiJHi i. На последнем пассаже 11рои3 5од;-т -сбор виругосодержащей жидг огтт, опреде-ля- ют титр вируса, идентиф1-:цируют ев ежеиаолированиый штамм ЦМВ п реакции

немтрсшизации со специфической иммунной сывороткой, полученной при гипер- иммунизацин кроликов эт. шонн1-.1М штаммом Ad-169. Устанопляч ПгГЙ штамм обозначают ЦМВ-493. Из культуры пятого пассажа готовят цитопог ичегкир препараты, которые окрашивают гемятокси- лином и эозином. При микроскопирова- нии в них выявляют характерные для

ЦМВ внутрияде1)ные включения - сови- ньш глаз.

Аналогичный штамм ЦМВ-493 с помощью тех же процедур рыгт.елен из слюны больного, которьш также идентифицирован как ЦМВ.

Пример 2, Купьтуру клеток штамма М-23 на уропне тридцатого пассажа готовят по способу, списанному в примере 1 , клеточную в весь вносят в 1,5-литровые матрасы.Кл,-тки инкубируют в термостате при в течение 3 сут до формирояаиия М-М1ОГЛОЯ.

Среду роста из матраса удаляют и вносят штамм Ad-169 цитомегалови- русов в виде цельной вирусосодержащей жидкости в объеме 10 чп при титре 5 Ig ТЦД /мл. Контакт вируса с клетками - 1 ч при 37 С. Затем в каждый матрас вводят 100 мл поддерживающей |среды и инкубируют при до момента равития цитопатических изменений в 80% клеток. Среду удаляют, клеточный слой однократно промывают питательной средой и добавляют 10 мл глицинового буфера, рН 9,5. Матрас с клетками помещают на 12 ч при 4 С, После этого взвесь клеток переносят в пробирку и центрифугируют при

2000 об/мин в течение 10 мин. В качестве антигена используют надосадоч- ную жидкость. Проводят предварительн титрование антигена с эталонной сывороткой в присутствии комплемента. Титр антигена 1:32. Основную реакцию ставят с разведением 1:16.

П р и м е р. 3. Культуру клеток штамма М-23 на уровне 27 пассажа готовят по способу, описанному в примере 1 .

Для оценки антивирусного действия ацикловира используют концентрации 0,25-250 мкг/мл.

В пробирку с монослоем вносят по 0,1 МП неразведенного ЦМВ с титром 5 Ig , адсорбцию вируса осуществляют в течение 1 ч, затем его удаляют, культуру промывают питательной средой и вводят поддерживающую среду, содержащую ацикловир в указанных концентрациях.

Учет результатов проводят ежеднев но в течение 13 сут. Ингибирующее действие црепарата установлено с дозой 250 мкг/мл: специфическое поражение клеток в контроле отмечено на вторые сутки, с ацикловиром - на шее тые, В последующие дни цитопатически изменения нарастают и к тринадцатым суткам регистрируют поражение клеточного пласта, аналогичное контролю.

На основании полученных результа- тов допустим, что ацикловир обладает ограниченной способностью подавлять репродукцию ЦМВ.

ПримерА. В культуральный сосуд с диплоидными клетками кожи и мышц эмбриона человека М-23 на уровне 21 пассажа вводят 0,25%-Hbni раствор трипсина, подогретого до . Через 5-7 с раствор удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 37 С на 2-3 мин.. Затем вносят небольшое количество питательной среды и энергичным встряхиванием заканчивают процесс отделения клеток от стекла. После этого в клеточную взвесь добавляют среду роста - Игла MEM - с 10% СКРС - и разливают на два сосуда. Эти культуры двадцать второго пассажа инкубируют при в течение 3 сут до момента формирования плотного монослоя.

Для заражения, используют штамм ЦМВ-493 на уровне пятнадцатого пассажа с титром 4 Ig . На седьмые сутки 80-90% клеток подвергаются специфической дегенерации, и титр ЦМВ равен 6 Ig ТЦЛ,-,/мл.

Пример 5. Культуру клеток штамма М-23 на уровне двенадцатого пассажа получают по способу, описанному в примере А, и заражают вирусом полиомиелита (штамм Сэбина, тип 1) из расчета 1 БОЕ на клетку. Культуру инкубируют при 34°С, Сбор вируса проводят на третьи сутки. Титр вирус в первичной культуре клеток почек африканских зеленых мартьш1ек равен 7,89 Ig БОЕ/МЛ.

П р и м е р 6, Культуру клеток штамма М-23 на уровне двенадцатого пассажа получают по способу, описанному в примере 1, и заражают вирусом полиомиелита (штамм Сэбина тип 11) по способу, описанному в примере 5. При этом титр вируса составляет 7,7 Ig БОЕ/МЛ.

Пример 7. Культуру клеток штамма М-23 на уровне девятого пассажа получают по способу, описанному в примере, 1, и заражают вирусом полиомиелита (штамм Сэбика, тип III) по способу, описанному в примере 5, При этом титр вируса составляет 7,96 Ig БОЕ/мЛо

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток кожи и мьш1Ц эмбриона человека BQKK-Д NД-3 (15/2/7) дпя изготовления диагностических препаратов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для вирусологических исследований и оценки антивирусного действия химиопрепаратов. Цель изобретения - получение нового штамма культивируемых диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемого для изготовления диагностических препаратов и размножения вирусов. Штамм получают трипеннизацией кожно-мышечных лоскутов 10-недельного эмбриона человека и адаптацией полученных клеток к стабильным условиям культивирования. Штамм обозначают М-23, он хранится во Всесоюзной специализированной коллекции клеточных культур Института медицинской генетики АМН СССР под номером Д-3 (15/2/7). Штамм способен к прививкам без снижения пролиферативной активности до 41 пассажа. Процент диплоидных клеток колеблется в пределах от 90,2 до 93,2, полиплоидных - от 0,6 до 1,9. Штамм обеспечивает накопление специфического антигена ИМВ в титре 1:32, используемого в РСК, и служит в качестве тест-системы для диагностики цитомегаловирусной инфекции. Штамм пригоден для накопления биомассы вируса полиомиелита.