Штамм культивируемых клеток сердца и языка эмбриона СеRсорнIтнесUS аетнIорS, используемый для выращивания вирусов Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12N5/02 

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии, медицине и касается получения нового штамма культивируемых ге- тероплоидных клеток сердца и языка эмбриона африканской зеленой мартышки 4179 для использования в вирусологической практике.

Целью изобретения является получение штамма культивируемых гетероплоидных клеток сердца и языка эмбриона африканской зеленой мартышки (Cercophithecus aeth iops), используемого для выращивания вирусов с неограниченным количеством субкультивирований.

0 П р и м е р 1. Штаммп 4179 получают следующим образом.

Все первичные культуры готовят из соответствующих органов и тканей эмбриона африканской зеленой мартышки (Cercophithecus aethiops), выделенного путем кесаревого сечения. Обезьяна № 4179 прошла 45-суточный карантин и была клинически здорова.

Дискретные клетки получают с помощью метода щадящей трипсинизации ку- сочков тканей и органов 0.25%-ным раствором трипсина при чередующихся контактах с питательной средой.

О

ю

CJ

g

Клетки ресуспендируют со средой Игла MEM и 10% СКРС и эксплантируют 10- 12х104 на 1 мл. Сосуды с клетками инкубируют при 30°С. В первичных культурах монослой развивается за 8-10 сут. В зависимости от срока формирования монослоя проводят первое субкультивирование, а все последующие по четкому графику - два раза в неделю, так что интервал между перевивками постоянно равен 3-4 сут. Исключение этого составлял штамм перевиваемых клеток стенки кишечника, так как его клетки обладают более низкой профилиративной активностью и субкультивирование проводили один раз в неделю. Кратность рассева для всех культур колебалась от 1:2 до 1:3. В процессе пассажей используют среду того же состава.

Отделение клеток от стекла осуществляют 0,25%-ным раствором трипсина, подогретым до 37°С.

Криоконсервируют клетки с использованием 10% глицерина, 10% СКРС и 80% среды роста. При восстановлении после замораживания используют среду роста,

В процессе субкультивирований было установлено, что наибольшей пролифера- тивной активностью обладала культура клеток сердца и языка, обозначенная как штамм 4179.

Создан банк посевных клеток на уровне 80-го пассажа в количестве 296 ампул, каждая из которых содержит 5x10 клеток.

Штамм 4179 депонирован в специализированной коллекции перевиваемых Соматических клеток позвоночных научно- исследовательского института вирусных инфекций, г. Свердловск, за N°. 324/88 (ВСКК/П).

Штамм 4179 характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства. После первичной эксплантации клеточный слой сформировался на 5-е сутки, Все последующие перевивки проводили два раза в неделю на 3-4-е сутки. Кратность рассева до 38-го пассажа 1:2, затем до 45-го 1:3, с 46-го до 88-го (срок наблюдения) 1:3 - 1:5. Культура в процессе изучения пропассиро- вана 128 раз. Кратность рассева зависит от качества сред и сывороток.

Первичная культура клеток сердца и языка имела смешанный состав. Отмечены фибробластоподобные клетки, округлые эпителиоидные и удлиненные миобласты. Указанная гетерогенность клеточного состава сохраняется примерно до 19-го пассажа, когда отмечено преобладание фибробластоподобных клеток над остальными. Примерно через следующие 10 пассажей количество эпителиоидных клеток значительно увеличилось, начиная с 36-го пассажа в культуре регистрируют примерно равное количество фибробластоподобных и

эпителиоидных клеток. Полиморфизм клеточного состава сохраняется и в последующих 20 пассажах, но начиная с 56-го пассажа фибробластоподобные преобладают. До конца наблюдения культура по клеточному

0 составу остается смешанной. Смена серий сывороток и сред вызывает изменение внешнего вида культуры с незначительным преобладанием то одного, то другого вида клеток,

5 Для перевивок применяют среду Игла MEM с 10% СКРС. В качестве криопротекто- ра используют 10% глицерина, клетки ресуспендируют в среде Игла MEM, содержащей 10% СКРС. с концентрацией

0 2x10 на 1 мл. Жизнеспособность клеток составляет 85±5%.

Создан банк посевных клеток на уровне 80-го пассажа в количестве 296 ампул, каждая из которых содержит 5- 10Ь клеток.

5 Проведено повторное изучение культу- ральных свойств клеток посевного банка и показана их стабильность на протяжении 50 пассажей (срок наблюдения). Количество клеток в одной 1,5-литровой матрасной кол0 бе колеблется в зависимости от кратности рассева от 35 до 56 х 106,

Культура сохраняется на стекло без смены среды и перевивок при кратности рассева 1:3 не менее трех недель.

5 При изучении видовой принадлежности показано, что изоферменты лактатдегидро- геназа и глкжозо-6-фосфатдегидрогеназа - энзимограммы обезьян.

Морфологические признаки.

0 Культура клеток сердца и языка африканской зеленой мартышки 4179 с помощью цитологических и цитохимических методов изучена на уровне 42-го. 60-го, 72-го, 106-го и 112-го пассажей. Культура неоднородна

5 rjp своему составу, что является следствием содержания в исходном материале клеточных элементов, являющихся производными почти всех зародышевых листков.

Основная масса клеток штамма 4179

0 (около 95%) представлена фиброластопо- добными и эпителиоидными клетками. Эпителиоидные - полигональные клетки с овальными и округлыми ядрами, варьирующими по величине в 1,5-2 раза. На препара5 тах, окрашенных гематоксилином и эозином, в ядрах таких клеток выявляются 1-4 ядрышка и мелкие глыбки хроматина. При постановке реакции по Шабадашу в цитоплазме видны мелкие глыбки гликогена. Эти клетки делятся обычными двуполюсным митозом. Фибробластоподобные клетки - удлиненные с двумя или несколькими отростками, а также веретеновидные различной величины. Ядра в них овальные с 1-3 ядрышками и мелкими глыбками хромати- на. Фибробластоподобные клетки часто располагаются тяжами и окружают эпители- одные.

На всех изученных пассажах обнаружены также округлые или отростчатые крупные многоядерные клетки, миобласты и небольшие мышечные трубочки. Содержание их меняются на разных пассажах и неоднородно даже по монослою.

В крупных многоядерных клетках число ядер варьировало от 3 до 15. Кроме того, в некоторых многоядерных клетках содержатся еще и многочисленные микроядра. В многоядерных клетках часто можно видеть многополюсные митотические деления с не- равномерным расхождением группы хромосом к нескольким полюсам. Деление цитоплазмы при этом часто не наблюдается. Отмечены митотические деления с асинхронным вступлением ядер в процесс кари- окинеза, что позволяет наблюдать в одной многоядерной клетке одновременно несколько фаз деления. В ряде многоядерных клеток отмечено образование крупных ядер неправильной формы. В цитоплазме много- ядерных клеток содержатся и глыбки гликогена, выявленные реакцией Шабадаша,

В штамме 4179 миобласты и мышечные трубочки составляют менее 1 %. Форма клеток миобластов вытянутая, ядро удлинен- ное, более компактное, чем у эпителиоидных и фибробластоподобных клеток. По мере пассажей число миобластов уменьшается. Мышечные трубочки отмечены до 112-го пассажа (срок наблюдения). Они имеют удлиненную форму и обычно 3-4 округлых ядра, расположенных друг за другом, содержат в цитоплазме глыбки гликогена. Миофибрилл с поперечно-полосатой исчерченностью в них не отмечено.

По периферии единичных клеток разных типов происходит плазматоз, а также фрагментация, пикноз ядер и деструкция цитоплазмы отдельных стареющих клеточных структур. Содержание и локализация ДНК и РНК, кислой и щелочной фосфатоз было обычное.

Внутриядерных и цитоплазматических включений, а также вакуолизации, характерных для цитопатологии, вызываемой ви- русами, не обнаружено. .

Кроме этого, установлено, что многоядерные и мышечные элементы штамма 4179 хуже сохраняются в жидком азоте и при восстановлении их содержание значительно снижается, что приводит к изменению морфологии культуры. Так, например, восстановленная после хранения в жидком азоте культура на уровне 72-го пзссажя состоит преимущественно из фибробластоподобных и полигональных эпителиоидных клеток.

Такое строение штамма 4179 делает его перспективным для использования не только в вирусологии, но также для изучения процессов взаимодействия клеток разного происхождения, закономерностей митоти- ческого желения, избирательной чувствительности различных клеточных элементов к вирусам и химическим веществам.

Кариологические признаки.

Кариологический анализ штамма 4179 проведен на уровне 79-го пассажа. Изучено 100 метафаз и установлено, что штамм - гетероплоидный. Число хромосом колеблется от 61 до 148. Основную массу составляют клетки с числом хромосом от 71 до 110 (82 %) без узкого модельного класса. Наивысший процент (34%) зарегистрирован в клетках, содержащих от 91 до 100 хромосом, следующая по величине группа (22 %) представлена клетками с числом хромосом от 71 до 80, наименьшая (4%) - от 61 до 70.

В каждой метафазе содержится от двух до четырех маркерных ядрышкообразую- щих хромосом с типичной для данного вида животных морфологией.

Кариологические данные свидетельствуют о поликлональной структуре популяции данного штамма клеток.

Контроль штамма 4179 на посторонние контаминанты.

При обследовании клеток штамма на стерильность (наличие бактерий, грибов,- микоплазм) были получены отрицательные результаты на уровнях 4-128-го пассажей.

При исследовании культуральных жидкостей и самих клеток на уровнях 35-го, 58-го и 88-го пассажей в чувствительных клеточных системах - в первичной культуре клеток почек африканской зеленой мартышки, в двух-штаммах диплоидных клеток эмбриона человека и в первичной культуре клеток почек кролика, а также в реакции гемадсорбции с эритроцитами морской свинки вирусы-контаминанты не выявлены.

При обследовании клеток штамма 4179 на тех же уровнях пассажей в опытах на новорожденных и взрослых белых мышах,, кроликах, морских свинках, куриных эмбрионах и иммунодепрессионных мышах линии СВА посторонних агентов, в том числе онко- генных, не обнаружено.

Чувствительность к вирусам. Определена чувствительность штамма 4179 к заражению вирусами полиомиелита.

К первичному заражению без адаптации культура оказалась чувствительна к вакцинным штаммам Сэбина трех типов. Максимальный титр (7,49 Ig БОЕ/мл) был получен со штаммом 111 типа. Для I и II типов этот показатель колебался от 7,2 до 7,4.

Штамм 4179 чувствителен к заражению вирусами клещевого и японского энцефалитов. В частности, титр вируса клещевого энцефалита достигал 9,8 Ig ЛДво/мл.

Пример 2. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина тип I.

В матрасную колбу вместимостью 1,5л с монослоем клеток 4179 на уровне 71-го пассажа вносят подогретый до 37°С 0,25%- ный раствор трипсина. Монослой ополаскивают несколько раз, жидкость удаляют, а культуру помещают в термостат при 37°С на 1-2 мин, Затем колбу встряхивают до полного отделения клеток и вносят 500 мл среды роста, клеточную взвесь энергично встряхивают и разливают в 20 флаконов вместимостью 100 мл по 25 мл в каждый. В качестве среды роста используют среду Игла MEM с 10% СКРС. Культуру инкубируют при 37°С в течение трех суток до момента формирования монослоя.

При заражении питательную среду удаляют, клеточный слой однократно промывают рабочим раствором Эрла и вирус полиомиелита вносят в разведении 10 с 15 мл среды ГЛАЭИ (0,5% гидролизата лак- тальбумина на растворе Эрла с равным количеством среды Игла). Инфицированные культуры инкубируют при 34°С. Учет результатов проводят, начиная с вторых суток после заряжения. Титр вируса полиомиелита, штамм Сэбина I типа равен 7,2 Ig БОЕ/мл. Пример 3. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина типа II.

Культуру клеток штамма 4179 на уровне 71-го пассажа получают и заражают по способу, описанному в примере 1, при этом титр вируса составил 7,44 Ig БОЕ/мл.

Пример 4. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина типа

Культуру клеток штамма 4170 на уровне 71-го пассажа получают и заражают по способу, описанному в примере 1, при этом титр вируса составил 7,49 Ig БОЕ/мл.

Пример 5. Способ культивирования

вируса клещевого энцефалита, штамм 139.

Культуру клеток штамма 4179 получают

по способу, описанному в примере 1. Перед

заражением питательную среду удаляют,

вирус клещевого энцефалита, штамм 139, вносят в культуру клеток в полном объеме среды поддержки (среда Игла MEM с 2% СКРС) из расчета 5-10 ЛД/клетка. Инфицированные культуры инкубируют при 37°С.

Учет результатов проводят на четвертые сутки.

При титровании проб вируссодержащей жидкости на беспородных белых мышах массой 7-8 г инфекционная активность вируса клещевого энцефалита, штамм 139, составляет 7,9 Ig ЛДбо/мл.

Пример 6. Адаптационное пассирование вируса клещевого энцефалита, штамм 139.

С целью повышения инфекционной активности вируса клещевого энцефалита проводят адаптационное пассирование в культуре клеток 4179. Для этого вируссодер- жащую жидкость, полученную по способу,

описанному в примере 4 (титр 7,9 Ig ЛДзо/мл), переносят в культуру клеток штамма 4179, подготовленную по способу, описанному в примере 1. Заражающая доза и условия репродукции вируса

те же. Процедуру повторяют дважды.

Адаптационное пассирование приводит к увеличению титра инфекционной активности, определяемой на уровне 11-го пассажа 8,7 Ig ЛДяо/мл, 111-го пассажа - 9,8 Ig ЛДбо/мл.

Пример. Способ культивирования вируса японского энцефалита, штамм Я-47. Культуру клеток штамма 4179 получают по способу, описанному в примере 1. Заражение клеток 4179 вирусом японского энцефалита, штамм Я-47, проводят по Способу,

описанному в примере 4. Титр вируса на 4-е

сутки после заражения равен 8,9 Ig ЛДю/мл.

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток сердца и

языка эмбриона Cercophithecus aethiops, BCKK(II) Me 324/88, используемый для выращивания вирусов.

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии и медицине и касается получения нового штамма культивируемых ге- тероллоидных клеток сердца и языка эмбриона африканской зеленой мартышки для использования в вирусологической практике. Целью изобретения является получение штамма культивируемых гетеропло- идных клеток сердца и языка эмбриона африканской зеленой мартышки ( Cercophithecus aethiops), используемого для выращивания вирусов. Указанная цель достигается выделением из соответствующих органов первичных культур с последующей оценкой их пролиферативной активности и способности к субкультивированию. Полученный при этом штамм депонирован в ВСКК (II) за № 324/88 и обладает высокой репродуктивной активностью в отношении вирусов полиомиелита, чумы плотоядных, клещевого и японского энцефалитов. Ё