Способ получения иммобилизованной липазы Советский патент 1991 года по МПК C12N11/08 C12N9/18 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению иммобилизованных ферментных препаратов, в частности к способам получения иммобилизованной липазы, и может найти применение в пищевой, легкой и химической промышленностях.

Известен способ получения иммобилизованной липазы, включающий обработку полиамидного носителя бифункциональными реагентами, в качестве которых используют глутаровый альдегид или госсипол.

Обработку носителя глутаровым альдегидом проводят при рН 8,5 в течение 1 ч, а

связывание с ферментом при 4°С в течение 12 ч 1.

Недостатками способа является низкая удельная активность целевого продукта (0,8 ед. на 1 г носителя) и невысокая стабильность (время полуинактивации 2,5 ч при 50°С).

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ иммобилизации липазы на полиамидном носителе с использованием в качестве бифункционального сшивающего реагента госсипола Согласно известному способу обработку носителя

О Ч)

г

VI ел

госсиполом проводят при 45-80°С и рН 8,0- 9,5 в течение 1-5 ч, а связывание фермента с носителем осуществляют при 0-16°С 2. Однако известный способ характеризуется недостаточно высокой активностью и термостабильностью получаемого продукта. Достигаемая удельная активность 14 ед./г носителя (субстрат-хлопковое масло), соотношение активности иммобилизованного и растворимого ферментов составляет 0,175, а время полуинактивации при 50°С составляет 3,5 ч.

Целью изобретения является повышение активности целевого продукта.

Согласно способу получения иммобилизованной липазы, предусматривающему обработку полиамидного носителя бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы 6 нейтральной или слабощелочной среде, и последующее связывание липазы с модифицированным носителем, в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуолдиизоциа- нат в количестве 1-2 мг на 1 г носителя, а после обработки бифункциональным реагентом проводят модификацию носителя пальмитиновой кислотой, устанавливая соотношение 20-30 мл пальмитиновой кислоты на 1 г носителя.

Использование предлагаемого способа позволяет увеличить удельную активность целевого продукта в 3,0-3,4 раза (от 14 до 42-48 ед./мг носителя).

П р и м е р 1. 1 г порошкообразного полиамида обрабатывают 4 н. HCI (100 мл) при 40°С в течение 2 ч, затем промывают трижды бидистиллированной водой (по 500 мл). Осадок полиамида отделяют декантацией или центрифугированием (5 мин, 2000 об/мин). Затем суспендируют в 10 мл диок- сана и прибавляют 1 мг 2,4-толуолдиизоци- аната, 3 капли триэтиламина и смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 20-25°С, затем полиамид отфильтровывают, промывают на фильтре диоксаном и смешивают с 20 мл суспензии пальмитиновой кислоты в диоксане, прибавляют несколько капель тризтиламина и смесь медленно перемешивают в течение 5 ч при 80°С. Носитель промывают суспензией пальмитиновой кислоты, ацетоном (3x100 мл) и 0,005 М фосфатным буфером (рН 7,8) до полного исчезновения ацетона.

Для присоединения фермента к модифицированному таким образом полиамидному носителю к его суспензии в 0,005 М

фосфатном буфере (рН 7,8) добавляют 20 мл раствора липазы с концентрацией белка 4 мг/мл и инкубируют в течение 6 ч при 4°С. Полученный целевой продукт промывают 0,1 М фосфатным буфером и активность фермента измеряют по его способности расщеплять хлопковое или оливковое масло. Удельная активность препарата 42,0 ед./г носителя.

П р и м е р 2. Все операции проводят по примеру 1, но используют 25 мл пальмитиновой кислоты. Удельная активность 48,0 ед./г носителя.

Примеры 3-7. Способ осуществляют

по примеру 1. варьируя количеством добавленной пальмитиновой кислоты (1-3,7 мл) или 2,4-толуол-диизоцианата (4-6 мл).

Данные исследования приведены в таблице.

Из данных таблицы следует, что полржи- тельный эффект достигается при добавлении 20-30 мл пальмитиновой кислоты. Понижение концентрации пальтиминовой кислоты приводит к снижению активности

целевого проудкта, а повышение ее концентрации нецелесообразно из-за увеличения расхода реагента без влияния на активность. Оптимальные концентрации бифункционального реагента 1-2 мг на 1 г

носителя.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет значительно увеличить удельную активность целевого продукта с 14 до 42-48 ед./г носителя (т.е. в

3,0-3,4 раза), а также несколько увеличить стабильность иммобилизованной липазы (время полуинактивации при 50°С возрастает с 3,5 до 6,0 ч).

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованной липазы , предусматривающий обработку полиамидного носителя бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы,

в нейтральной или слабощелочной среде и последующее связывание липазы с модифицированным носителем, отличающий- с я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуол- диизоцианат в количестве 1-2 мг на 1 г носителя, а после обработки бифункциональным реагентом проводят модификацию носителя пальмитиновой кислоты, устанавливая соотношение 20-30 мл пальмитиновой кислоты на 1 г носителя.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения иммобилизованной липазы, и может найти применение в пищевой, легкой и химической отраслях промышленности. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта. Способ заключается в обработке полиамидного носителя - капрона бифункциональным агентом, несущим изоцианатные группы, а именно 2,4-толуолдиизоцианатом