Способ получения иммобилизованной холинэстеразы Советский патент 1989 года по МПК C12N11/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а конкретно к способу получения иммобилизованных ферментов - холинэстераз, которые могут быть использованы в аналитических системах и ферментных реакторах о

Цель изобретения - увеличение стабильности иммобилизованных холинэ сте- раз.

Способ заключается в сорбционной и ковалентной иммобилизации ферментов на силохромах и последующем включении, в пенополиуретан. Иммобилизованные на силохроме холинэстеразы вво г ,

дят в смесь микродиизоцианата (на основе полиоксипропиленгликоля и 2,4- толуилендиизоцианатд) и воды, взятых .в соотношении соответственно 0,3: 1:0,05 - 0,2 (по массе), тщательно перемешивают до образования ny3ijipbKOB газа и отверждения „ Полученные образы представляют собой мел- копориетую эластичную губку, обеспечивающую высокую фильтруемоеть жидкости 0,018-0,079 мл/см Со Стабильность иммобилизованных ферментов значительно возрастает, так как время полуинактивации увеличивают до 1444

sj

ю ел

о

280 ч (по сравнению с 6-48 ч в из- веетном способе).

Пример 1. Сорбция бутирид- холинэстеразы (БХЭ) на силохромах (СХ-1 и СХ-3).

Навеску силохрома 1,5 г в течение 2-3. ч уравновешивают в 10 мл 0,015 М фосфатного буферного раствора с ,5. Затем буфер сливают и к насителю приливают 10 мл раствора фермента с удельной активностью 1,25 ед.мг, белка и концентрацией 1,0 мг/мло Сорбцию проводят в течение 2 ч при постоянном перемешива- НИИ. По завершении сорбдии силохром отфильтровьшают и промывают фосфатным буферным раствором с , 5 от избытка фермента. Количество сорбированной бутирилхолинэстеразы оп.ре- деляют спектрофотометрическим методом при 280 -ммк по разности концентраций фермента в растворе до и после сорбции. Полученный гетерогенный биокатализатор содержит 27,5 мг бу- тирштхолинэстеразы на 1 г носителя, удельная активность 1,15 ед/мг белка.

Синтез уретанового форполимера (макродиизоцианата) проводят следую- щим образом. В трехгорлый реактор, снабженный мешалкой, термометром, трубкой для ввода аргона, помещают .полиоксипропиленгликоль (ПОПГ) (мм 1000) и добавляют к немУ при энер- гичном перемешивании свежеперегнанный толуилендиизоцианат (ТДИ). Реакцию проводят при 388-393 К в течение 1,5-2,0 ч в токе аргоне при соотношении ПОПГ:ТДИ-1,0:2,5. Окончание реакции определяют по процентному содержанию изоцианатных групп (NCO 6,7-6,9). Полученный макродиизоциа- нат хранят в сухой, герметически закрытой посуде

На фторопластовую подложку помещают 1 г уретанового форполимера, добавляют 0,15 г силохрома, содержащего сорбированную бутирилхолинэсте- разу. Смесь тщательно перемешивают до однородной массы, затем прибавляют 0,1 г , Перемешивание продолжают до начала выделения.пузырьков газа (C0,j) и оставляют образец до полного вспенивания и отверждения. Полученная гетерогенная- биосистема представляет собой мелкопористую высокоэластичнзто губку, содержащую 4,0 мг бутирилхолинэстеразы. Относительная ак,тивность иммобилизованного биокатализатора, определенная электрохимическим методом равна 0,001 6 |Ц А, а время полуинактивации (Т ;,, ) 144 ч. Измерения электрохимическим методом проводят на потенциостате П-2857. В качестве рабочего и вспомогательного используют платиновые электроды, электродом сравнения служит насыщенньй каломельный электрод. 0,015 М фосфатньм буфер и 10 М раствор субстрата ацетил,- или бутирилтиохолинйодида из сосудов перекачиваются лри помощи многоканального перестальтического насоса в смеситель, затем в термо- статируемый реактор при С и смесь подается в колонку, заполненную носителем с иммобилизованным ферментом. На выходе из колонки продукты реакции поступают в проточную электрохимическую ячейку, подключенную к потенциостату П-2857(8).

Запись производят при помощи потенциометра. При прокачивании через ячейку буферного раствора регистрируется фоновый ток, соответствующий нулевой линии. При пропускании раствора субстрата без фермента регистрируется малый остаточный ток. Подключение в системе колонки с иммобилизованным ферментом проявляется как характерный пик тока, величлна которого зависит от количества образовавшегося продукта реакции. Последняя, в свою очередь определяется физиологической активностью иммобилизованной системы. Учитывая .этр.величина пика тока может служить показателем относительной активности данной биокаталитической системы. Удельная активность арепарата равна 1,10 ед/мг белка, фильтруемость 0,039 мл/см. с.

Пример 2. Иммобилизация бутирилхолинэстеразы на аминосило- хроме при ковалёнтной пришивке фермента к носителю.

К 0,3 г аминированного силохрома приливают 10 мл 2%-ного водного раствора глутарового альдегида и смесь интенсивно перемешивают в те- чение 10 мин. После окончания обработки носитель тщательно отмьшают от избытка диальдегида сначала водой, а затем фосфатным буферным раствором с ,7. Регистрацию степени отмывки осуществляют спектрофотометри 1есКИМ методом при .длине волны 235 мк, К обработанному глутаровым альдеги- .дом силохрому приливают 10 мл раствора бутирилхолинэстеразы с концентрацией J,7 мл/мл, и уделШюй активностью ед/мг белка, Ковалент- иую сшивку осуществляют в течение 2 ч при постоянном перемешивании. По окончании иммобилизации сило хром отфильтровьшают и промьшают буфером от избытка фермента. Регистрацию бутирилхолинэстеразы осуществляют спектрофотометрическим методом при длине волны 280 ммк. Полученная гетерогенная биок аталитичес- кая система содержит 26,0 мг белка на 1 г носителя с удельной активностью 1,18 ед/мг белка. Затем в форК 0,1 г аминосилохрома приливают 12 мл 2%-ного водного раствора глу тарового альдегида. Активацию сило хрома- производят в течение JO мин. После обработки носитель отфильтровьшают и тщательно промывают снача ла дистиллированной водой, а затем

полимер, полученный по примеру 1, до- зо о,015 М фосфатным буферным раствобавляют гетерогенный биокатализатор. Иммобилизацию биосистемы завершают, добавляя при формировании пенополиуретана 0,05 г воды. Т,12 равно 150ч его относительная активность составляет 0,0019 fU А, Удельняя активность 1,13 ед/мг белка, содержание фермента 3,9 мг белка 1 г носителя, Фильт- руемость 0,018 мл/см -с,

ПримерЗ, Сорбционная иммо- билизация ацетилхолинэстеразы на си- лохроме,

Навеску сорбента 0,2 г уравновешивают в 10 мл 0,015 М фосфатного буферного раствора с ,3 в течение 2 ч. Затем носитель отфильтровывают, к нему приливают 5 мл раствора ацетилхолинэстеразы (АХЭ) с концентрацией 4,8 мг/мл и удельной активностью 0,45 ед/мг белка. Сорбцию проводят в течение 2 ч при постоянном перемешивании на качалке. После иммобилизации избыток фермента сливают, силохром промывают фосфатным буферным раствором, с ,3, Количество связавшейся ацетилхолинэстераг зы определяют по разности концентраций белка в растворе до и после сорбции. Регистрацию фермента осуществляют спектрофотометрическим методом при длине волны 280 ммк, Полученный продукт содержит 31,1 мг ацетилхолинэстеразы на 1 г носителя с удельной активностью 0,41 ед/мг белка. Сило- хром с сорбциоино связанным ферментом вводят в формполимеро Иммобилизацию завершают, добавляя 0,2 г , Фильтруемость 0,079 мл/см -с. Относиром с ,5 с целью -удаления избы ка диальдёгида. К обработанному сил хрому приливают 5 мл фосфатного буферного раствора с ,5. содержа- щего 4,8 мг/мл ацетилхолинэстеразы с удельной активностью 0,45 ед/мг белка. Ковалентную сшивку осущес вляют в течение 2 ч при постоянном перемешивании на качалке. После иммобилизации избыток фермента отфиль ровывают, силохром промывают фосфат ным буферным раствором с ,5. Оценку количества связанного биокат лйзатора осуществляют в соответстви с примером 1. В результате ковалент

30

35

ной сшивки получают гетерогенную

биокаталитическую систему, содержа щую 80 мг ацетилхолинэстеразы на 1 носителя с удельной активностью

40 0,42 ед/мг белка, Аминированный сил хром с ковалентно пришитой АХЭ за тем вносят в форполимер. Вспенива ние и отверждение полученной биосис темы производят в соответствий с пр

45 мером 1, добавляя лишь 0,15 мл воды Фильтруемость 0,056 мл/см -с. Опред ление активности иммобилизованной б осистемы, электрохимически покаэыва ет, что полученный гетерогенный био

50 катализатор обладает относительной активностью 1,23 (Ц А, Т,, равно 240 ч. Удельная активность АХЭ 0,41 ед/мг белка, содержание фермен та 12 мг/г носителя.

55

Пример 5 (сравнительный), Иммобилизацию АХЭ и БХЭ осуществляю по примеру 4, используя рН буферного раствора равного 5,5, В форполк

0

5

тельная активность иммобилизованного препарата, определенная электрохимически, составляет 1,17 U А, Т, равно 280 ч. Удельная активность 0,39 ед/мл белка, содержание фермента 4,7 мг/г носителя,

Пример 4, Ковалентное связывание ацетилхолинэстеразы на ами- нированном силохроме с последующим введением биосистемы в пенополиуретан,

К 0,1 г аминосилохрома приливают 12 мл 2%-ного водного раствора глу- тарового альдегида. Активацию сило- хрома- производят в течение JO мин. После обработки носитель отфильтровьшают и тщательно промывают сначала дистиллированной водой, а затем

о о,015 М фосфатным буферным раствором с ,5 с целью -удаления избытка диальдёгида. К обработанному сило- хрому приливают 5 мл фосфатного буферного раствора с ,5. содержа- щего 4,8 мг/мл ацетилхолинэстеразы с удельной активностью 0,45 ед/мг белка. Ковалентную сшивку осуществляют в течение 2 ч при постоянном перемешивании на качалке. После иммобилизации избыток фермента отфильтровывают, силохром промывают фосфатным буферным раствором с ,5. Оценку количества связанного биоката- лйзатора осуществляют в соответствии с примером 1. В результате ковалент

ной сшивки получают гетерогенную

биокаталитическую систему, содержащую 80 мг ацетилхолинэстеразы на 1 г носителя с удельной активностью

0,42 ед/мг белка, Аминированный силохром с ковалентно пришитой АХЭ затем вносят в форполимер. Вспенивание и отверждение полученной биосистемы производят в соответствий с при-

мером 1, добавляя лишь 0,15 мл воды, Фильтруемость 0,056 мл/см -с. Определение активности иммобилизованной биосистемы, электрохимически покаэыва- ет, что полученный гетерогенный биокатализатор обладает относительной активностью 1,23 (Ц А, Т,, равно 240 ч. Удельная активность АХЭ 0,41 ед/мг белка, содержание фермента 12 мг/г носителя.

Пример 5 (сравнительный), Иммобилизацию АХЭ и БХЭ осуществляют по примеру 4, используя рН буферного раствора равного 5,5, В форполк

мер добавляют 0,01 мл воды, Экспер - ментальные исследования показывают, что в следствие недостатка не происходит вспенивание форполимера. Образовавшаяся биосистема получается в виде .монолитного материала - пленки (а не.губки). Фильтруемость О мл/см 1с.

П р и м е р . 6 (сравнительный). Проводят связывание АХЭ и БХЭ на ами- нированном силохроме, В процессе постановки эксперимента единственным отличием является введение в форпо- лимер 0,005 г гетерогенного биокйта- лизатора АХЭ (или БХЭ). Результаты исследований показывают практическое отсутствие физиологической активности иммобилизованной биосистемы. Пример 7 (сравнительньй). Иммобилизацию АХЭ и БХЭ осуществляют согласно примера 1, Отличительным признаком примера является введение в фррполимер 0,5 г силохрома. Исследования показывают, что избыток сило- хрома забивает поры пенополиуретана, и образовавшая биосистема обладает плохой фильтруемостью.

Пример 8 (сравнительн ьш). Согласно примера 1 осуществляют иммобилизацию АХЭ и БХЭ на силохромах. При -иммобилизации ферментов применяют буферный раствор с Установлено, что иммобилизованные биосистемы не проявляют физиологической активности вследствие инактивации ферментов,

Пример 9 (сравнительный). По примеру 3 проводят иммобилизацию АХЭ и БХЭ. При иммобилизации ферментов и в процессе определения физиологической активности используют 0,015 М фосфатньй буферный раствор с ,4. Установлено, что при данном рН происходит растворение носителя - силохрома.

Пример 10. Иммобилизацию проводят по примеру 1, изменяя.соотношение компонентов микродиизоциа- нат:вода:силохром до 1:0,25:0,15. Фильтруемость 0,097 мл/см -с

Предложенное в способе соотношение введенной воды (0,05-0,2) обусг ловлено следующим. Минимальное количество (0,01) приводит к.получению монолитного материала у пленки, не обладающим признаком фильтруемос- ти. Максимальное количество воды

0

5

0

5

0

5

50

55

(Oj25) приводит к образованию биокатализаторов с такой высокой степенью фильтруемости, что проходящий через ферментный реактор субстрат не успе-. вает прореагировать с ферментом.

Предложенный диапазон (0,1-0,3) введенного силохрома с иммобилизованным ферментом обусловлен следующими причинами. Введение в пенополиуретан гетерогенного катализатора менее 0,1 показывает отсутствие физиологической активности системы, а введение более 0,3 г силохрома с иммобилизованным ферментов цриводит к получению системы, обладающей плохой фильтруемостью, поскольку избыток силохрома забивает поры пенополиуретана.

/

При использовании в примере 1 силохрома в СХ-Ги СХ-3 получены идентичные результаты.

Таким образом, использование данного способа позволяет получить препараты иммобилизованных холинэстераз с более высокой стабильностью со временем полуинактивации 144-280 ч . вместо 6-48 ч в известном способе. При этом силохром и ферменты, включенные в массу пенополиуретана в процессе его получения не вымываются из иммобилизованной системы злю- ируемыми растворами субстратов. Полученные иммобилизованные системы обладают хорошими технологическими характеристиками, выраженными в высокой степени фильтруемости гетерогенных биокатализаторов. Совокупность положительных свойств иммобилизованных биосистем дают возможность использовать их в сигнализаторах токсичности и анализаторах метаболитов, а также в- ферментных реакторах для синтеза биопрепаратов.

Формула, изобретения

Способ получения иммобилизованной холинзстеразы, заключающийся во включении холинэстеразы в пористый пенополиуретан, полученный на основе макродиизоцианата, о т л и- чающийся тем, что, с целью увеличения стабильности целевого продукта, холинэстеразу предварительно адсорбируют или ковалентно связывают с силохромом, а включение полученной связанной холинэстеразы в порис9147250310

тый пенополиуретан ведут в процессе со связанной холинэстеразой в соот- его образования путем перемешивания ношении 1:0,05 - 0,2:0,1 - 0,3 (по макродиизоцианата, воды и силохрома массе) до вспенивания и отверждения.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сигнализаторах токсичности и анализаторах метаболитов, а также в ферментативных реакторах для синтеза ценных биоорганических препаратов. Целью изобретения является увеличение стабильности иммобилизованных холинэстераз. Способ заключается в проведении ковалентного или адсорбционного связывания холинэстераз на силохроме с последующим введением силохрома со связанными ферментами в смесь воды и макродиизоцианата и перемешиванием гетерогенной системы до вспенивания и отверждения. Соотношение микродиизоцианата, воды и силохрома устанавливают равным 1:0,05...0,2:1,0...0,3 (по массе). Полученные препараты иммобилизованных холинэстераз обладают повышенной стабильностью (Т_1/2= 144-280 ч), а также удобными механическими свойствами, например фильтруемостью.