Способ получения иммобилизованной липазы Советский патент 1981 года по МПК C12N9/18 C12N11/08 

Изобретение относится к технической биохимии, в частности к способам получения иммобилизованной липазы. Известен способ получения иммобили зованной липазы, включающий обработку полиамидного носителя (капрон) бифункциональным реагентом, в качестве которого используют глутаровый альдегид, при щелочных значениях рН, температуре и весовом соотношении глутаровый альдегид: носитель (0,380,39) : 1 и связывание липазы с полученным носителем также при щелочных значениях рН. Обработку носителя глутаровым альдегидом обычно проводят при рН 8,5 в течение часа, а связывание с ферментом - при 4° С в течение 12 ч . Однако для данного способа харак.терна недостаточно высокая активность и термостабильность получаемого продукта. Достигаемая удельная активность 0.8 ед/г (хлопковое масло) и 213 ед/г (трибутирин), соотношение активности иммобилизованного и растворимого ферментов составляет 0,66 и 0,01 (соответственно на указанных субстратах). Время полуинактивагщи при составляет 2,5 ч (за час иммобилизованный фермент теряет 20% активности). Целью изобретения является повышение активности и термостабильности иммобилизованной липазы. Указанная цепь достигается тем, что в качестве бифункционального реагента используют госсипол формулы сно он и обработку им носителя, ведут при в есовом соотношении соответственно (0,253,0):100 и температуре 45-80°С. Кроме того, обработку ведут при рН 8,0-9, 3 в течение 1-5 ч. При этом связывание липазы с носителем осуществляют при 0-16°С. Активность фермента определяют по его способности расщеплять хлопковое масло и трибутирин. Пример 1. 10 мг порошкообраз ного полиамида обрабатывают 4 и. НС1 (1 мл) при 45с втечение 2 ч, затем промывают трижды дистиллированной водои (по 5 мл). Осадок полиамида отделяют декантацией или центрифугировани ем (5 мин, 2000 об/мин) . К влажном осадку добавляют 2 мл раствора госсипола в 0,1 М боратном буфере с рН 8,8 с концентрацией 0,05 мг/мл и выде живают при 80С в течение, ч. Избыто госсипола удаляют центрифугированием (5 мин, 2000 об/мин) с последующим пр мыванием осадка ацетономСЗ х 2 мп). Дпя подсоединения фермента к модифицированному таким образом полиамидному порошку, его промывают 0,1 М борат ным буфером срН8,8 (2x5 мл) и добавляют 1 МП раствора липазы с концен трацией 10 кг/мп и инкубируют в течение J6 ч при С, Полученный целевой . 4 продукт промывают 0,1 М боратным буфером, а затем дистиллированной водой. Активность фермента измеряют по его способности расщеплять хлопковое масло. Пример 2. Все операции проводят, как в примере 1, но концентрация госсипола 0,005 мг/Hii, температура , время 5ч. При концентрации сшивающего агента 0,005; 0,01; 0,025; 0,05 мг/мл удельная активность (с хлопковым маслом) составляет 10,2; 14,0; 9,0 и 8,2 ед/г соответственно. При соотношении (по весу) сшивающего агента и носителя 0,25 : 100; 0,5 : 100; 1 : 100; 2 : 100; 3 : 100 удельная активность соответственно 13,1; 13,5; 14,0; 13,7; 14,0 ед/г. При рН среды 7,5; 8,0; 8,5; 8,8; 9,5 удельная активность соответственно 2,0; 7,0; 14,0; 13,7 и 5,0 ед/г. В таблице приведены результаты сравнения каталитической активности и стабильности нерастворимой липазы, полученной по предлагаемому способу и известному.

А , А Примечание. ТБ г А /А Из таблицы видно, что применение госсипола при прочих равных условиях позволяет повысить каталитическую активность. Кроме того, целевой продукт, полученный по предлагаемому способу, обладает высокой стабильностью. Время удельные активности, измеренные с трибутирином и хлопковым маслом, р - растворимый фермент, и - иммобилизованный; отношение удельных активностей иммобилизованных и растворимых липаз. 5 полуинактивации при составляет 3,5 ч, вместо 2,5 ч, а при фермент может функционировать от 48 ч до 30 сут. Таким образом, изобретение прзволя ет повысить каталитическую активность иммобилизованного фермента в I,5-2 раза и увеличить стабильность нерастворимой липазы, а следовательно, и длительность использования. Формула изобретения 1. Способ получения иммобилизованной липазы, предусматривающий обработку полиамидного носителя - капрона бифункциональньм реагентом, несущим альдегидные группы, в щелочной среде и связьгеание фермента с полученным носителем, отличающийся тем, что, с целью повышения активнос ти и термостабильности целевого продукта, в качестве бифункционального 34 еагента используют госсипол - соеди ение формулы СНО QH ОН СНО а обработку им носителя зедут при весовом соотношении соответственно (0,25-3,0) : 100 и температуре 45-80Гс. 2.Способ по п. 1, отлича ю-, щ и и с я тем, что обработку носителя госсиполом осуществляют при рН 8,09,5 в течение 1-5 ч. 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что связывание липазы с носителем осуществляют С. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Рахимов М. М. Джанбаева Н. Р, и Бе.резин И. В. Субстратная специфичность иммобилизованных липаз. ДАН СССР, 1976, т. 229, № 6, 1481-1486 (прототип).