Способ консервирования рекомбинантного штамма РSеUDомоNаS SpecIeS продуцента @ -2 интерферона Советский патент 1991 года по МПК C12N1/04 C12N1/04 C12R1/38 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для хранения генноинженерных штаммов.

Цель изобретения - повышение выход а а-2 интерферона.

Сущность изобретения заключается в том; что для продуцентов а-2 интерферона - рекомбинантных штаммов Pseudomonas species, есть оптимальная точка консервации культур - 15-30 мин после достижения максимальной скорости роста для длительного хранения в жидкой среде с 15%-ным глицерином и антибиотиками в замороженном состоянии при (-70)-(-196)°С, способствующая .повышению выхода рекомбинантного интерферона а-2 в последующих фер- ментациях.

П р и м е р 1. Приготавливают для ферментера Biostat E фирмы В.Вгаиш Melsungen емкостью 13,7 л с рабочим объемом 10 л питательную среду (10 л) следующего состава, г/л: гидролизат казеина (ФС-42-632-72 МРТУ 42) 120 мл/л; гидро- лизат пекарских дрожжей 5; калий фосфорнокислый деузамещенный трехводный 1,5; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,6; аммоний сернокислый 3; натрий хлористый 0,5; магний сернокислый семиводный 0,25; кальций хлористый 0,011; тетрациклин 0,05; стрептомицин 0,15.

ю

|оо

СП

1 л этой среды разливают в 4x250 кача- лочные колбы и засевают (по 1 л) жидкоза- консервированной культурой Pseudomonas species, несущей плазмиду pVG-З (штамм депонирован во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики). Колбы помещают на 20-22 ч в термостатирующие качалки при 30-35°С. Полученным инокуля- том засевают ферменту.

Ферментацию проводят при 3Q-35°C, рН среды поддерживают автоматически на уровне 7,0-7,1, пеногашение на уровне датчика, р02 изменяют по Динамике роста от 40 до 70% до насыщения.

Каждые 30 мин берут пробы для измерения оптической плотности и определения скорости роста клеток

V(k)

X(k)-X(k-i) t(k)-t(k-i)

где Х(к), Х(к-1) - оптическая плотность в моменты времени.

Полученное значение скорости роста бактерий V(k) сравнивают с предыдущим значением V(k-i). Спустя 15-30 мин после удовлетворения условию V(k) - V(M) 0 культуру готовят к консервированию.

Для этого в стерильных условиях центрифугируют 400 мл культуральной среды, осадок клеток ресуспендируют в 200 мл свежей среде указанного состава, добавляют антибиотики и 200 мл стерильного растао- ра глицерина. Полученную суспензию клеток разливают по 1 мл в пластмассовые пробирки типа Эппендорф емкостью 1,5 мл. Емкость с пробирками помещают в холодильник глубокого охлаждения при -20°С на 22-24 ч, а потом перемещают в кельвинатор и хранят при температуре (-70...75) - (-196)°С в течение 1,5 года.

Динамику биосинтеза рекомбинантно- го а-2 интерферона определяют иммунным методом.

Результаты экспериментальных исследований приведены в тзбл.1 и.отображены на чертеже, где на графике 5 исходного варианта отмечены цифрами в кружках точки консервирования. Консерванты, полученные в этих точках, были использованы для

осуществления четырех ферментации, которые в табл.1 обозначены соответствующими вариантами.

Из экспериментальных данных, представленных на чертеже и в табл.1, следует, что по сравнению с исходной ферментацией в последующих ферментациях 1-4 биосинтетические свойства повышаются. Во 2-м варианте, где консервация осуществле0 на при максимальной скорости роста, выход продукта повышается на 7%, а в 3-м варианте, где консервация произведена через 30 ммн после достижений максимальной скорости роста, - на 20%,

5 П р и м е р 2. Результаты обработки экспериментальных данных, приведенные в табл.2, показывают, «то предлагаемый способ консервации рекомбинантного штамма Pseudomonas species VG-84 - лро0 дуцентаа-2 интерферона, позволяет повысить выход продукта по сравнению с известным в 1,74 раза.

Предлагаемый способ пригоден для других штаммов Pseudomonas sp.- проду5 центов рекомбинантного интерферона (2-2. э именно штэмм ауксотроф по аденину, другие два - по треонину. Каждый штамм обла- дает специфически обработанными плазмидами. Активность рекомбинантного

0 интерферона а -2 в ферментациях, засеянных культурами законсервированными по предлагаемому способу, повышается в о 0,5-1.74 раза по сравнению с известным способом.

5

Формула изобретения Способ консервирования рекомбинантного штамма Pseudomonas species-

0 продуцента а -2 интерферона, предусматривающий отделение свежевыращенных клеток путем их центрифугирования, ре- суспендирование осадка в свежей среде с глицерином и антибиотиками, консервиро5 вание в стеклянных или пастмассо вых ампулах и хранение при -(70) - (-196)°С, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода интерферона, консервирование осуществляют через 15-30 мин после того,

0 как скорость роста достигает своего максимального значения.

Таблица 1

Примеча вне. t - время;

X - концентрация микроорганизмов (бактерий); V - скорость роста бактерий;, INF - концентрация интерферона.

Пр одолже Дне та бл.1

Таблица 2

a INF

i(f№/A

5h

0

418

10

12

14WIB

Отн.ед. опт.