Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинатными бактериями РSеUDомоNаS SpecIeS Советский патент 1992 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и технологии получения человеческого лейкоцитарного интерферона.

Цель изобретения - повышение выхода конечного продукта.

Способ осуществляется следующим образом.

На основании экспериментальных данных разработан способ температурной оптимизации биосинтеза рекомбинантного альфа-2 интерферона бактериями Pseudomonas species, согласно которому через 15-30 мин после достижения максимальной скорости роста бактерий температуру среды понижают от 30±0.5 до 20±0,5°С и процесс завершают в начале стационарной фазы или через 2.5±0.5 ч после снижения температуры, достигая максимального биосинтеза интерферона альфа-2, т.е. полностью используя потенциал питательной среды: возможность температурной деградации готового продукта исключается.

На основании известного графического метода было произведено представление на фазовых плоскостях скорости роста бактерий и концентраций продукта. На фиг.1 показана скорость роста продуцента (в %) от максимальной скорости роста, в табл.Т числовые значения. Спустя определенный

промежуток времени после того, как бактерии, культивируемые при 30°С, достигают максимальную скорость роста, следует снизить температуру до 20°С, Это должно не только исключить деградацию продукта, что характерно для 30-градусного режима ферментации, но и повысить производительность.

Из экспериментальных данных (фиг.1 и 3 и табл.1 и 3 видно, что продукт после максимального накопления в клетке практически не подвергается температурной деградации при выращивании культуры при 15 и 20°С, а при выращивании при 25 и 30°С деградация продукта начинается сразу же после его максимального накопления. При снижении температуры до 15°С клетки получают слишком большой температурный шок и рост культуры практически прекращается. Культивирование при 15°С замедляет процесс, выход интерферона альфа-2 в 2 раза ниже, чем при 3.0°С. При снижении температуры до 25°С желаемого эффекта не достигается, так как после накопления продукта наступает его деградация так же, как и при ./

Из фиг.1 видно, что, когда скорость роста снижается до 80%, при 30°С начинается деградация продукта, а при 20°С в этой точке увеличивается биосинтез продукта и остается стабильным еще 3 ч (табл. 1). При 25°С (фиг.З) получается гибридный вариант, т.е. при снижении скорости роста до 80% происходит увеличение биосинтеза, но потом сразу наступает деградация продукта.

Следовательно, температуру культивирования следует понижать от 30±0,5 до 20±0,5°С до начала деградации продукта, т.е. через 15-30 мин после достижения максимальной скорости роста (табл.).

Процесс культивирования следует завершить через 2-3 ч после снижения температуры потому, что после 2,5±0,5 ч, но не раньше (табл.2), наступает деградация продукта. Завершение процесса определяется по времени, так как оптическая плотность повышается незначительно.

П РИ мер. Приготавливают 10 л питательной среды для ферментера Blostat Е емкостью 13,7 л с рабочим объемом 10 л следующего состава, г/л: гидролизат казеина 120 Мл/л; гидролизат пекарских дрожжей 5; D-глюкоза 10; сернокислый аммоний 3; фосфорнокислый однозамещенный калий 0,6; хлористый натрий 0,5; сернокислый семиводный магний 0,3; хлористый кальций 0,011; тетрациклин 0,05; стрептомицин 0,15. 1 л этой среды разливают в 4 250-качалочные колбы и засевают по 1 мл жидкозаконсервированной культуры Pseudomonas species VG-84. Колбы помещают на 20±2 ч в термостатирующие качалки при 200±20 об/мин и температуре 30±0,5 С,

Полученным инокулятом засевают ферментер. К ферментеру подключают бутыли с 10%-ным раствором силиконового пеногасителя, 40%-ным раствором гидроокиси натрия и 35%-ным раствором фосфорной

0 кислоты.

Ферментацию начинают при 30°С, рН среды поддерживают автоматически на уровне 7, пеногашение на уровне датчика. Каждые 30 мин берут пробы культуральной

5 жидкости для измерения оптической плотности на спектрофотометре СФ-26 при А 540 нм в кювете толщиной 1 см и определения скорости роста. Оптическую плотность (ПО) изменяют по динамике рос0 та: после засева ПО поддерживают на уровне 40% от насыщения, при достижении 2,5-3 оптических единиц (опт.ед.) - 50%, при 4,5-5 опт.ед. - 60%, при 6,5-7 опт.ед. 70% от насыщения.

5 Скорость роста определяют следующим образом.

Информация об оптической плотности среды поступает на ЭВМ IBM/PC. Посредством метода сглаживающих кубических

0 сплайнов сглаживают (фильтрация) поступающие данные с точностью до 0.2 опт.ед.

Скорость роста бактерий (V) определяют из выражения

Хк-Хк-1

VK

tK - tK - 1

где Хк и Хк-1 - фильтрованные сигналы в моменты-времени Тк и tK-i.

Полученное значение скорости роста

бактерий Vk сравнивали с предыдущем

значением VK-I. Спустя 15-30 мин после

удовлетворения условия VK - VK-I О темпе. ратуру среды снижают с 30±0,5 до 20±0,5°С

и процесс биосинтеза завершают в начале

стационарной фазы или через 2,5±0,5 ч поеле снижения температуры.

Таким образом, способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинантными бактериями, Pseudomonas species позволяет полностью использовать потенциал питательной среды и повысить ВЫХ.ОД конечного продукта в 6-7 раз по сравнению с известным способом (см. табл.1 и 2 и фиг.2).

Формул а изобретения Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинантными бактериями Pseudomonas species путем глубинного культивирования. в присутствии стрептомицина итетрациклина на питательной среде, содержащей гид ролитат пекарских дрожжей, D-глюкозу, сернокислый аммоний, фосфорнокислый однозамещенный калий, хлористый натрий, сернокислый семиводный магний и хлористый кальций при регулировании РОа и при 30±0,5е, рН 7,0±0,1, От личающийсй

Кинетика роста бактерий и биосинтез альфа-2 интерферона (INF) при разных температурах

тем, что, с целью повышения выхода конечного продукта, температуру среды понижают до 20±0,5С после достижения максимальной скорости роста бактерий, а процесс культивирования завершают через 2,5±0,5 ч после снижения температуры.

т а б п и ц а 1

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и к технологии получения человеческого лейкоцитарного интерферона. Целью изобретения являетсястабилизация и повышение выхода конечного продукта. Способ получения человече-- ского лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинатными бактериями Pseudomonas species путем глубинного культивирования в присутствии стрептомицина и тетрациклина на питательной среде, содержащей Гид- ролизат пекарских дрожжей. D-глюкозу, сернокислый аммоний, фосфорнокислый однозамещенйый к'алий, хлористый натрий, сернокислый семиводный магний и хлористый кальций при регулировании РОг при температуре 30±0,5°С, рН 7,0±0,1, определения скорости роста бактерий, заключается в том. что через 15~30 мин после достижения максимальной скорости роста бактериями температуру среды понижают от 30±0,5 до 20±0.5°С и процесс.завершают через 2,5±0,5 ч после снижения температуры, что позволяет стабилизировать и повысить выход альфа-2 интерферона. 3 ил:. 3 табл../• .-вё

Кинетика роста бактерий и -биосинтез эльфа-2 интерферона (INF) при снижении температуры с 30 до

Та6лица2

Кинетика роста бактЬрий и биосинтез альфа-2 интерферона (INF) при разных температурах

ТабяицаЗ W60 Фиг.1 100 cfjift/t,%

Melf-to

1,4 i,i ifl a,s

.

0 0,

ii 6 в fff

0

W j

гг f

QJuz.Z

0 го

т 100 effkti.

60 Фиг.З