СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАСС РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, ОБОГАЩЕННЫХ ПОЛИПЕПТИДАМИ СО СВОЙСТВАМИ ЦИТОКИНОВ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2000 года по МПК C12N1/21 C12N15/19 C12N15/27 C12N15/28 C12P21/00 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ получения биомасс рекомбинантных штаммов E.coli, содержащих плазмидные ДНК, кодирующие биосинтез цитокинов со свойствами факторов некроза опухолей α и β (ФНО-альфа и ФНО-бета), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) и гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и несущие в качестве селективного маркера ген bla (устойчивость к ампициллину). Полученные биомассы могут быть использованы для выделения и очистки из них рекомбинантных цитокинов: ФHO-α, ФHO-β, Г-КСФ и ГМ-КСФ, с целью их детального исследования и применения в медицинской практике.

Цитокины - это белки, вырабатываемые преимущественно активированными клетками иммунной системы и являющиеся медиаторами межклеточных взаимодействий при иммунном ответе, гемопоэзе, воспалении, а также межсистемных взаимодействиях. Традиционно цитокины разделяют на несколько групп: интерлейкины, интерфероны, факторы некроза опухолей (ФНО), колониестимулирующие факторы (КСФ) и др. В организме они действуют взаимосвязанно, образуя единую цельную цитокиновую сеть [1,2]. Все это делает перспективным детальное исследование этих белков и применение в медицине [3-7] и, как следствие, актуальна разработка способов их получения.

Известны способы получения цитокинов, основанные на использовании культуральной жидкости продуцирующих их клеточных линий [8-13]. Однако эти способы трудоемки, трудно масштабируемы, не позволяют получать белки в больших количествах; и только техника рекомбинантных ДНК позволила нарабатывать цитокины в количествах, доступных для широкомасштабного исследования и применения в медицинской практике. Способы получения рекомбинантных цитокинов микробиологическим синтезом с использованием рекомбинантных плазмид известны [14-24] и бурно развиваются [25-32].

Одной из первых основополагающих стадий технологии получения белков является стадия получения биомассы клеток рекомбинантного штамма-продуцента. Обычно, компетентные клетки штамма-реципиента (чаще всего клетки Escherichia coli) трансформируют плазмидой, несущей ген целевого белка и селективный генетический маркер (обычно ген устойчивости к антибиотику). Трансформанты выращивают на среде с антибиотиком и далее размножают трансформированные клетки в ферментере с целью получения биомассы. При этом часто при выращивании клеток необходимо проводить индукцию промотора для экспрессии гена целевого белка с помощью специальных индукторов или повышением температуры [15,19-22] , что приводит к усложнению и удорожанию технологии производства. Наиболее технологично, когда целевой белок экспрессируется в ходе выращивания клеток постоянно, без индукции [16,17, 24-32]. Тем не менее практика показывает, что процесс получения качественной биомассы рекомбинантных штаммов-продуцентов крайне нестабилен, содержание целевых белков в ней невелико (от 3% до 10% от суммы клеточных белков), а также сильно варьирует от опыта к опыту [10,22,24,30,32] . Основной причиной нестабильности биомассы по продуктивности является сегрегация плазмид и селективное преимущество в скорости размножения клеток, не содержащих плазмиду [33-37]. Для повышения качества биомассы рекомбинантных штаммов авторы работ [33-36] рекомендуют тестировать отдельные клоны трансформантов на содержание целевого белка и использовать для получения инокулята наиболее продуктивные из них, в качестве посевного материала использовать культуру в первой трети - середине логарифмической фазы роста, усилить селективное давление на клетки в ходе ферментации путем повышения в среде концентрации антибиотика, подбором в ходе роста культуры оптимальной температуры для синтеза нужного метаболита. Первые две рекомендации авторов являются бесспорными и применимы для всех исследованных рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих ФHO-α, ФHO-β, α2- интерферон. Однако увеличение в среде концентрации антибиотика для усиления селективного давления, используемого успешно в работе [35] для культивирования штамма E. coli SG20050/pIFN16 - продуцента лейкоцитарного интерферона α2, не всегда резонно, т. к. может привести к резкому снижению скорости роста культуры и снижению выхода биомассы [34] . Изменение температуры при выращивании рекомбинантного штамма может привести не только к изменению уровня синтеза целевого белка, но и изменить его конформационное состояние [37,38]. Этот параметр в каждом случае требует специального исследования.

Наиболее близким (прототипом) к заявляемому способу является способ получения биомассы рекомбинантного штамма бактерий E.coli, обогащенной полипептидом со свойствами лимфотоксина человека [39, прототип]. Стабилизация процесса биосинтеза лимфотоксина и повышение его процентного содержания в биомассе в 2,0-2,5 раза достигается путем отбора высокопродуктивных клонов клеток-трансформантов для получения посевного материала, получения посевного материала на плотной среде с добавлением в среду второго антибиотика - хлорамфеникола с целью увеличения амплификации плазмиды и сбором биомассы клеток в конце логарифмической фазы роста культуры. Совокупность указанных приемов позволяет получать биомассу с содержанием целевого белка 10-16% от суммы клеточных белков. К недостаткам способа следует отнести низкую технологичность на стадии получения посевного материала (инокулята), т.к. получение его на твердой питательной среде трудно масштабируется, и узкий специализированный прием увеличения плазмидной ДНК в штамме-продуценте, подходящий только для улучшения рекомбинантных штаммов, содержащих в плазмиде ген устойчивости к хлорамфениколу.

Технической задачей предлагаемого изобретения является стабилизация процессов биосинтеза группы человеческих цитокинов (ФHO-α, ФHO-β, Г-КСФ и ГМ-КСФ) и повышение их процентного содержания в биомассе рекомбинантных штаммов, содержащих в качестве селективного маркера ген β-лактамазы (устойчивость к ампициллину, Ap^r).

Задача решается путем обработки посевного материала ампициллином в повышенной концентрации (400-500 мкг/мл) с целью разрушения накопившихся бесплазмидных клеток и последующим дробным добавлением антибиотика в процессе ферментации.

Сущность предлагаемого способа получения биомассы рекомбинантных штаммов E.coli заключается в следующем:
Плазмидой, содержащей целевой ген цитокина (pTNF311 Δ либо pLT21, либо pGG8, либо 280GM), трансформируют компетентные клетки Escherichia coli SG20050, трансформанты подращивают на плотной селективной среде (Ap, 50-150 мкг/мл) в течение 16-18 ч при температуре 30-32^oC. Колонии трансформантов анализируют на содержание целевого белка. Наиболее продуктивные засевают в жидкую селективную питательную среду (Ap, 50-150 мкг/мл) и выращивают до одной трети - середины логарифмической фазы роста. Затем в культуру добавляют ампициллин до концентрации 400-500 мкг/мл и инкубируют в течение 2-3 ч. Полученной культурой засевают ферментер с селективной питательной средой (Ap, 100 мкг/мл), и клетки выращивают до конца логарифмической фазы роста. При этом в ходе ферментации периодически через 1-2 ч добавляют ампициллин в концентрации 100 мкг/мл среды. В конце логарифмической фазы роста клетки собирают центрифугированием и используют для выделения цитокина сразу или после хранения при температуре -70^oC.

Анализ посевного материала (инокулята) на содержание плазмидсодержащих клеток (Ap^r) показал, что их количество колеблется от опыта к опыту от 60 до 80% (табл. 1), т.е. около 20- 40% популяции клеток уже на стадии получения посевного материала даже из высокопродуктивных колоний трансформантов могут потерять плазмиду и далее, быстро размножаясь в процессе ферментации, вытеснят плазмидсодержащие клетки, что приведет к низкому качеству биомассы.

Для удаления бесплазмидных клеток из инокулята используют обработку его ампициллином в повышенной концентрации 400-500 мкг/мл в течение 2-3 ч. При этом показано (табл.2), что после такой обработки бесплазмидные клетки E.coli SG20050 (Ap^s) практически полностью теряют жизнеспособность. Анализ культуральной жидкости на белок методом электрофореза показывает, что клетки лизируются (белки выходят в культуральную жидкость) (фиг. 1). Способность к росту трансформированных клеток E. coli после такой обработки полностью сохраняется (табл.2).

Анализ популяции клеток посевного материала (инокулята) на содержание плазмидсодержащих клеток после обработки его высокими концентрациями (400-500 мкг/мл) ампициллина показал, что их количество увеличивается и составляет не менее 90% (данные табл. 1).

В связи с тем, что селекция по ампициллин резистентности не является эффективной, поскольку плазмидные клетки синтезируют β- лактамазу, которая, являясь секретируемым белком, разрушает ампициллин в среде, то с целью усиления селективного давления в ходе ферментации и подавления роста Ap^s клеток, появляющихся в ходе роста культуры в результате сегрегации плазмиды, необходимо периодически добавлять в среду ампициллин. Экспериментально показано, что целесообразно это делать при вступлении культуры в логарифмическую фазу роста, через каждые 1-2 ч.

Новыми по сравнению со способом-прототипом признаками являются: обработка посевного материала рекомбинантных штаммов ампициллином в концентрации 400-500 мкг/мл в течение 2-3 ч для удаления бесплазмидных клеток и дробное добавление в среду ампициллина в концентрации 100 мкг/мл при ферментации культуры в экспериментально подобранное время для снижения сегрегации плазмиды и накопления бесплазмидных клеток.

Совокупность указанных признаков позволяет повысить выход целевых белков в биомассе, стабилизировать процесс их биосинтеза и постоянно получать качественную биомассу рекомбинантных штаммов: E. coli SG200-50/pTNF311 Δ (продуцент ФHO-α), E.coli SG20050/pLT21 (продуцент ФHO-β), E.coli SG20050/pGGF8 (продуцент Г-КСФ) и E.coli SG20050/p280GM (продуцент ГМ-КСФ), содержащую целевые белки в количестве не менее 10% от суммы клеточных белков. Содержание ФHO-α в биомассе в среднем повысилось в 1,5 раза, ФHO-β - в 4 раза, Г-КСФ - в 2-3 раза и ГМ-КСФ - в 8 раз.

Графические материалы:
Фиг. 1. Анализ культуральной жидкости (без клеток) на наличие клеточных белков после инкубации клеток E.coli SG20050 с различными концентрациями ампициллина (мкг/мл): 1-0; 2-50; 3-100; 4-200; 5-400; 6-600; 7-800; 8-1000.

Ниже следуют примеры конкретного получения обогащенных цитокинами (ФHO-α, ФHO-β Г-КСФ и ГМ-КСФ) биомасс рекомбинантных штаммов E.coli SG20050, содержащих плазмиды с генами вышеперечисленных цитокинов и геном β-лактамазы (ген bla) в качестве селективного маркера.

Пример 1. Получение трансформированных клеток, отбор высокопродуктивных клонов и выращивание их в жидкой селективной среде
Трансформацию компетентных клеток E.coli SG20050 плазмидной ДНК pTNF311 Δ [40], или pLT21 [24], или pGGF8 [30], или p280GM [32] проводят кальциевым методом, как описано ранее [41]. Отбор высокопродуктивных клонов проводят, как описано в способе-прототипе [39]. Клоны с наибольшим содержанием целевого белка используют для получения инокулята. Их подращивают в L-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина при 32^oC до середины логарифмической фазы роста (Д₅₅₀ = 0,5-0,6).

Анализ полученных клеток на содержание плазмидсодержащих клеток проводят методом, описанным в [42]. Полученные данные представлены в табл. 1 (графа 2).

Как видно из таблицы, процентное содержание Ap^r клеток в посевном материале колеблется от 60 до 85%.

Пример 2. Влияние ампициллина на жизнеспособность реципиента E.coli SG20050 и рекомбинантного штамма E.coli SG20050/pGGF8.

Исследован процесс влияния различных концентраций ампициллина на жизнеспособность штамма-реципиента E. coli SG20050 и рекомбинантного штамма-продуцента Г-КСФ, данные представлены в табл.2 и фиг. 1.

Как видно из табл.2, после инкубации реципиента клеток (Ap^s) в среде с антибиотиком (до 400 мкг/мл) в течение 1 ч, отдельные колонии сохраняют способность к росту при высеве на среду без селективного давления, тогда как после 3-часовой инкубации их роста не наблюдается. В то же время после инкубации трансформированных клеток (Ap^r) в тех же условиях их способность к росту практически не изменяется.

Из фиг. 1 видно, что при обработке реципиентных клеток антибиотиком в культуральной жидкости начинают обнаруживаться в значительных количествах клеточные белки E. coli при концентрациях ампициллина выше 400 мкг/мл, что указывает на лизис клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что до этих концентраций антибиотика происходит подавление роста бесплазмидных клеток, но они могут сохраняться в нативном состоянии, и при инактивации ампициллина β-лактамазой способны к интенсивному росту. После обработки клеточной популяции ампициллином в концентрации 400-500 мкг/мл в течение 2-3 ч можно ожидать гибель бесплазмидных клеток.

Пример 3. Получение посевного материала с повышенным содержанием Ap^r клеток.

Отобранный высокопродуктивный клон, выращенный на чашке отдельно растущими колониями, смывают в жидкую среду в качалочные колбы с объемом L-бульона 200 мл и дозой ампициллина 100 мкг/мл. Подращивают культуру при температуре 32^oC и скорости вращения качалки 150-160 об/мин до первой трети - середины логарифмической фазы роста (Д₅₅₀=0,5-0,6). Далее проводят инкубацию с ампициллином в концентрации 400-500 мкг/мл в течение 2-3 ч.

В табл. 1 (графа 4) представлены результаты анализа полученной популяции клеток. Как видно из табл. 1, обработка инокулята антибиотиком в концентрации 400-500 мкг/мл в течение 3 ч способствует повышению уровня Ap^r клеток, и их содержание достигает 90%.

Пример 4. Ферментация без дробного добавления ампициллина.

Ферментацию проводят в качалочных колбах с объемом среды 250 мл или в ферментере "Ультраферм" с рабочим объемом 4 л при температуре 31-32^oC. Питательная среда - L-бульон, содержащий Ap в концентрации 100 мкг/мл. Скорость вращения качалки 150-160 об/мин. Скорость вращения мешалки в ферментере от 100 до 200 об/мин, подача воздуха 0,5-1,0 л/мин на 1 л среды. Для засева используют посевной материал, полученный, как описано в примере 3. Объем посевного материала 1% (об/об) от объема среды для ферментации. Время ферментации 9-10 ч. Заканчивают ферментацию в конце логарифмической фазы роста. Культуральную жидкость охлаждают до 5-10^oC, клетки собирают центрифугированием и хранят при температуре минус 70^oC. Данные по содержанию плазмидсодержащих клеток в ходе ферментации представлены в табл. 3-6 (графы 1-3).

Содержание целевого белка в биомассах колеблется от опыта к опыту и составляет от суммы клеточных белков в %: ФHO-α - 10-15%, ФHO-β - 1-3%, Г-КСФ - 1,0-4,0%, ГМ-КСФ - 1-4%.

Пример 5. Ферментация с дробным добавлением ампициллина.

Ферментацию проводят, как описано в примере 4, за исключением того, что в процессе ферментации через каждые 1-2 ч роста добавляют в среду ампициллин до концентрации 100 мкг/мл. Данные по содержанию плазмидсодержащих клеток в процессе ферментации представлены в табл. 3-6 (графы 4-7). Целевые белки в биомассах всегда присутствуют в количестве не ниже 10% от суммы клеточных белков: ФHO-α - 15 -25%, ФHO-β - 10-16%, Г-КСФ - 10-12%, ГМ-КСФ - 10%.

Таким образом, предлагаемый способ получения биомасс рекомбинантных штаммов E.coli SG20050, содержащих ген bla в качестве селективного маркера, позволяет стабилизировать процесс биосинтеза 4-х целевых белков-цитокинов, исключить "холостые" производственные ферментации и повысить их содержание в биомассе: ФHO-α в 1,5 раза, Г-КСФ и ГМ-КСФ в 2-3 раза. Содержание ФHO-β в биомассе не ниже, чем в способе-прототипе, но процесс получения инокулята универсален и легко масштабируется.

ЛИТЕРАТУРА
1. Кетлинский С.А., Симбирцев А. С., Воробьев А.А. // Эндогенные иммуно-модуляторы.- СПб: Гиппократ.- 1992.- С.256.

2. ЯрилинА.А.//Иммунология.- 1997.-N 5.-С.7-14.

3. Варпаховская И. //Remedium. 1998.- N 2.- Р.45-49.

4. Моисеенко В.М. //Вопросы онкологии.- 1998.- Т.44.- N1.-С. 120-125.

5. Нейпоген. Информационные материалы фирмы Ф.Хоффманн-Ля Рощ АГ, Базель, Швейцария.- 1993.

6. Смирнова Н.Б. // Клиническая фармакология и терапия.- 1995.-N 4.-С. 49-51.

7. Лейкомакс. Информационные материалы фирмы "Sandoz".- Базель.- Швейцария.- 1993-1994.

8. Патент США N 48333127, кл. A 61 K 37/02, 1989.

9. Nomura Н., Imazeki I., Oheda M., Kubota N et al.// EMBO J.-1986.- N 5.-P.871-876.

10. Европ. патент N 215126, кл. C 12 N 15/00. - 1987.

11. Патент США N 4604284, кл. A 61 K 37/02; C 07 K 13/00; C 12 P 21/00, опубл. 05.08.1986.

12. Aggarwal B.B., Moffat В. and Harkins R.N. //J. Biol. Chem.- 1984.- V.259.- N 1.- P.686-691.

13. Lee F., Yokota Т., Otsuka T. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985.- V.82.- P.4360-4364.

14. Заявка WO 86/03751, кл. A 61 K 37/02, 45/02, опубл. 03.10.1986.

15. А.С. СССР 1614765, кл. C 12 N 15/28, опубл. 15.12.1990.

16. Shirai Т. , Yamaguch H., ltoH. et al. //Nature, 1985.- V.313.- P. 803-806.

17. Тихонов Р. В., Якимов С.А., Коробко В.Г., Вульфсон А.Н. // Биоорг. Химия.- 1996.- Т.22.- N3.- C.163- 167.

18. Патент США 4617378, кл. C 07 K 15/26, опубл. 14.10.1986.

19. Heng-Fong Seow, Cynthia R.Coh, Kristman L., Porter A. // Biotechnology.-1989.- V.7.-N 4.- P.363-368.

20. Schoenfeld H. J. , Poesche D., Frey J.R. et al. // J. Biol. Chem.- 1991.- V.266.-N 6.- P.3863-3869.

21. Европ. патент N215126, кл. C 12 N 15/00, 1987.

22. Патент США N 4810643, кл. C 12 N 15/00, 1989.

23. Европ. патент N 0299782, кл. C 07 K 13/00, опубл. 18.01.1989. Б. 89/03.

24. Патент РФ N2048521, кл. C 12 P 21/00, 1992.

25. Патент РФ 2101292, кл. C 07 K 1/36, C 12 P 21/00, опубл. 10.01.1989, Б N1.

26. Патент РФ 2102988, кл. A 61 K 35/00, 35/26, 35/76, 39/00, опубл. 27.01.1998, Б N3.

27. Патент РФ N2082430, кл. A 61 K 38/21, опубл. БМ N 8, 1997.

28. Заявка на патент РФ N 97110634 от 20.06.97.

29. Заявка на патент РФ N97105785 от 10.04.1997.

30. Заявка на патент РФ N96113021. От 21.06. 1996. Положительное решение от 26.09.1997.

31. Заявка на патент РФ N 97106895 от 23.04.1997.

32. Патент РФ N2091488, кл. C 12 N 1/21, опубл. БИ N27, 1997.

33. Лебедев Л.Р., Зернов Ю.П., Пустошилова Н.М. и др. // Биотехнология.- 1995.- N 12.- С. 19-24.

34. Андреева И. С., Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М. // Биотехнология.-1996.- N1.- С.9-12.

35. Андреева И.С., Закабунин А.И., Пучкова Л.И. и др. // Биотехнология.- 1996.- N10.- С.18-23.

36. Лебедев Л. Р. , Пустошилова Н.М., Синичкина С.А., Андрева И.С. // Прикладная биохимия и микробиология.- 1998.- Т.34.- N1.- С.120-126.

37. Шмелев В.А., Бунина З.Ф., Кудрявцева Т.Ю. и др. // Мол. генет. микробиол. и вирусол.- 1995.- N1.- С.9-14.

38. A.C. 1712416, кл. C 12 N 15/00.

39. Способ получения биомассы рекомбинантного штамма бактерий E.coli, обогащенной полипептидом со свойствами лимфотоксина человека.//Заявка N 97103807, положительное решение от 23.04.1998.

40. Патент РФ N 1445193, кл. 6 C 12 N 15/28. Опубл. 20.03.96, Б. N8.

41. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // Молекулярное клонирование.- М.: Мир.- 1984. С.

42. Луста К.А., Фихте Б.А. // Методы определения жизнеспособности микроорганизмов.- Пущино.: ОНТИ НЦБИ СССР. 1990.- С. 186.

Изобретение предназначено для биосинтеза цитокинов человека (факторов некроза опухолей альфа и бета, гранулоцит и гранулоцит-макрофаг колониестимулирующих факторов) рекомбинантными штаммами Е. соli SG20050/pTNF322Δ, Е. coli SG20050pLT21, E. coli SG20050/pGGF8 и E.coli SG20050/p280GM. Для получения посевного материала с высоким содержанием плазмидсодержащих клеток инокулят обрабатывают ампициллином в концентрации 400 - 500 мкг/мл в течение 2-3 ч. В процессе ферментации в среду добавляют ампициллин до концентрации 100 мкг/мл. Ампициллин добавляют через каждые 1-2 ч роста культуры. Изобретение понижает сегрегационную нестабильность рекомбинантных штаммов и повышает содержание целевых белков в биомассах. 5 з.п.ф-лы, 1 ил., 6 табл.

1. Способ получения биомасс рекомбинантных штаммов бактерий Escherichia coli, обогащенных полипептидами со свойствами цитокинов человека, включающий трансформацию компетентных клеток Escherichia coli плазмидами, содержащими гены цитокинов человека, высев на селективную среду, содержащую ампициллин, получение инокулята из предварительно отобранных высокопродуктивных клонов, ферментацию и сбор биомассы, отличающийся тем, что трансформацию компетентных клеток проводят плазмидами, содержащими bla-ген в качестве селективного маркера, а для получения инокулята с высоким содержанием плазмидосодержащих клеток проводят обработку посевного материала ампициллином в концентрации 400 - 500 мкг/мл в течение 2 - 3 ч и дробное добавление этого же антибиотика в процессе ферментации через каждые 1 - 2 ч роста культуры. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве штамма-реципиента используют штамм бактерий Escherichia coli SG 20050. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что трансформацию компетентных клеток проводят плазмидой pTNF311Δ, содержащей ген фактора некроза опухолей-α человека (ФНО-α). 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что трансформацию компетентных клеток проводят плазмидой pLT21, содержащей ген фактора некроза опухолей-β человека (ФНО-β). 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что трансформацию клеток проводят плазмидой pGGF8, содержащей ген гранулоцит-колониестимулирующего фактора человека. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что трансформацию компетентных клеток проводят плазмидой p28GM, содержащей ген гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора человека.