Способ отбора мутантов парафинусваивающих дрожжей Советский патент 1991 года по МПК C12N15/01 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам отбора мутантов микроорганизмов для получения биомассы.

Целью изобретения является ускорение селекции дрожжей, обладающих повышенной способностью усваивать короткоцепочечные н-парафины.

Отбор мутантов прозодят как на плотных, так и на жидких питательных средах, содержащих селектирующий агент, каприлат натрия. Концентрацию подбирают таким образом, чтобы основная масса клеток исходного штамма не способна была образовывать колонии. Этой способностью обладают лишь немногие мутантные клетки дрожжей, приобретшие ее в результате действия мутагена. На каждом этапе селекции концентрацию каприлатанатрия увеличивают, а мутагенной обработке подвергают лучший из мутантов, полученных на предыдущем этапе селекции.

Суспензию клеток исходного штамма обрабатывают мутагеном и высевают на плотную или жидкую селективные питательные среды, содержащие каприлат натрия в концентрации, полностью подавляющей рост исходного штамма (применительно к нашему обьекту концентрация селектирующего агента постепенно повышалась от 0,02 до С,15 %). Выжившие в этих условиях и образовавшие отдельные колонии мутанты после очистки рассевом на той же среде проверяют на скорость роста и на уровень накопления биомассы при культивировании на жидкой парафинсодержащей среде.

П р и м е р 1. Суспензию клеток дрожжей Candida maltosa ВСБ-899 (лучшего из известных промышленных продуцентов кормового белка на основе н-парафинов)

О

чэ

00

$

о

выращивают в -специальных качалочных колбах емкостью 500 мл на высокоскоростной качалке (240 об/мин) при 30°С в жидкой питательной среде (по 50 мп) следующего состава, мас.%: Парафины Новополоцкого НПЗ 0,4 (Сэ следы, Сю 2.5; Ci; 8,6; С 12 13,8; С|з 18,1 ;Ci4 19,5; Cis 16,6; Cie 10,7; Ci 7,4; С18 2,0; Cig 0,2; КдНРСМ . ЗН-Ю 0,38; NatoPO x2HzO 0,35; MgCte 0,11; (МНф-ЗОд 0,422, водопроводная вода - остальное, рН 5,0-5,5.

Полученную суспензию обрабатывают химическим мутагеном нигризогуанидином концентрацией 1 мг/мл 15-60 мин, затем отмывают мутаген фосфатным буфером, рН 7,0.

Суспензию микроорганизмов высевают по 0,1 мл на чашки Петри с питательной средой, имеющей следующий состав, мас.%: этиловый спирт 0,4; минеральные компоненты,как в составе среды,приведенном рыше, каприлат натрия 0,01-0,03; водопроводная вода - остальное.

На I стадии селекции используют водорастворимый источиих углерода этанол,так как пути его ассимиляции близки с таковыми алканов. Исходный штамм ВСБ-899 очень чувствителен к каприлату натрия, даже концентрация 200 мг/л полностью подавляет его рост.-Устойчивые к згой концентрации мутанты образовывали видимые колонии только через 7 су т. Более высокие концентращ-н (0,03 %) настолько подавляют рост, что даже отдельных колоний на среде не возникало. Меньшие концентрации (0,01 %) не обладают селектирующим действием - на чашках вы- ростзл сплошной газон.

Устойчивые к хаприлату натрия колонии отсевают и очищают рассевом разведенных суспензий на среде того же состава.

Очищенные колонии каприлатустойчи- вых мутантов проверяют на продуктивность как по биомассе и скорости роста, так и исходным материалом для дальнейшей селекции на повышение степени устойчивости к каприлату натрия.

Проверку каприлатустойчивых мутантов на продуктивность по биомассе и определение удельных скоростей роста проводят на средах, где минеральные компоненты были, как в примере 1, а источником углерода были ч одном случае парафины в количеств0,4 мас.% (достаточном для измерения), а в другом - смесь парафинов с октаном и додеканом (2:1:1) - .0,4 мас.%.

Результаты исследования продуктивности мутантоп в сравнении с исходным штаммом на I стадии селекцги показывают, что мутанты варьируют по выходу биомассы от

90 до 115% от исходного штамма, причем повышенной продуктивностью обладают около 45% проверенных вариантов.

II этап - селекция на устойчивость к

возрастающим концентрациям каприлата натрия. Ее осуществляют двумя путями. Параллельно с селекцией на плотных селективных средах (с концентрациями каприлата натрия 0,05 и 0,08%) проводят

0 автоселекцию дрожжей (с концентрацией каприлата натрия 0,1%) длительным культивированием их (в течение 2 мес) в глубинных условиях - в колбах на качалке (условия культивирования в колбах описывались вы5 ше).

Селекция на средах со все возрастающими концентрациями каприлата натрия преследует следующие цели. На первом ее этапе, где каприлат натрия с концентрацией

0 0,02% используют 8 качестве селектирующего фактора, отбирают формы, имеющие устойчивость к каприловой кислоте. На следующем этапе селекции, где единственным источником углерода в среде служит кзпри5 лат натрия, возникают мутанты, способные расти на повышенной концентрации этого вещества.

По-видимому, автоселекция на среде с каприлзто м натрия как единственным ис0 точником углерода приводит к отбору форм с повышенной активностью ацил-КоА-син- тетазы. На каждой ступени повышения устойчивости дрожжей к каприлату натрия возникают мутации различных генов, в ре5 зультате чего отбирают формы с активацией нескольких ферментативных стадий процесса ассимиляции алкзнов.

П р и м е р 2. Селекцию каприлатустойчивых мутантов на повышение степени ус0 тойчивости к возрастающим дозам каприлата натрия 0,05 и 0,08 % проводят как в примере 1, Минеральные компоненты среды были такими же, как и в среде примера 10 а в качестве единственного источника уг5 лерода служил каприлат натрия, соответственно 0,05 и 0,08%. Все процедуры выполняют так, как описано в примере 1.

П р и м е р 3, Автоселекцию каприлатустойчивых мутантов, отобранных в примере

0 1, осуществляют длительным культивированием их в глубинных условиях в колбах на качалке (условия культивирования описаны в примере 1). Все минеральные компоненты среды как в примере 1, а каприлат натрия в

5 количестве 0,1 % служит единственным источником углерода. Все жизнеспособные в селективных условиях мутанты после очистки проверяют на продуктивность. Кроме го- го, продолжают селекцию на устойчивость к еще большим концентрациям каприлата натрия тех мутантных форм,-которые были выделены в результате автоселекции,

П р и м е р 4. Селекцию на пов ышение степени устойчивости к каприлату натрия в концентрациях 0,12; 0,15; 0,18 и 0,20% проводят как в примере 1. первые два режима селекции (0,12 и 0,15% каприлата натрия) даютмножество мутантов. НасредесО,18% образуется несколько колоний, однако после пересева жизнеспособных форм не было выделено. На максимальной из использованных концентраций каприлата натрия не обнаруживают ни одной колонии спустя 3 недели культивирования.

В таблице показаны основные характеристики исходной культуры и выделенных мутантов.

0

5

Как видно из таблицы, некоторые выделенные мутанты, прошедшие селекцию в несколько этапов, на 32% продуктивнее, чег., исходная культура и их предшественники.

Формула изобретения Способ отбора мутантов пэрафинусваи- вающих дрожжей, включающий обработку культуры мутагеном, рассев и выращивание на питательной среде с селектирующим агентом, отличающийся тем, что, с целью ускорения селекции дрожжей, обладающих повышенной способностью усваивать : ороткоцепочечные н-парафины, в качестве селектирующего агента используют каприлат натрия.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам отбора мутантов микроорганизмов для получения биомассы. Целью изобретения является ускорение селекции дрожжей, обладающих повышенной способностью усваивать короткоцепочечные н-парафины. Суспензию клеток исходного штамма обрабатывают мутагеном и высевают на плотную и жидкую селективные питательные среды, содержащие каприлат натрия в концентрации, полностью подавляющей рост исходного штамма. Выжившие в этих условиях и образовавшиеся отдельные колонии мутантов после очистки рассевом на той же среде проверяют на скорость роста и на уровень наполнения биомассы при культивировании на жидкой парафинсодержащей среде. 1 табл. сл С

Сравнение способности по накоплению биомассы и удельных скоростей роста в периодическом культивирований на качалке исходного штамма дрожжей Candida maltoda ВСБ-899 и мутантов, полученных селекцией на каприлате натрия разными способами

1Исходный штамм Candida maltosa

ВСБ-89945,0 0,061,92±0,1070,0 0,05 1,40f;0,01 Мутанты, полученные селекцией на плотных средах (в скобках указана концентрация каприлата натрия в среде)

231 (0,05%)0,062,02±0,630,06 1,54+0,11

365 (0,12%)0,061,8910,20 С,06 1,51±0,16

475 (0,12%) 0,,14+0.090,06 1,57+0,06

592 (0,15%)0,061,99+0,120,07 1,85±0,35

Мутанты, полученные автоселекцией на жидкойсреде Ј каприлатом натрия (0,1%)

6lilt0,072,26iO,460,06

7460,061,91.1:0,260,06

,092,54+0,580,03

9560,092,46+0,580,05

1,54+0,15 1,,02

0,98±0,53 1,45+0,10

1,54+0,15 1,,02

0,98±0,53 1,45+0,10