Питательная среда для селекции этанол-усваивающих микроорганизмов Советский патент 1980 года по МПК C12K1/06 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для селекционного улучшения продуцентов кормового белка. Одним из путей повышения продуктивности микрооргащзмов является увеличение cKopocra их роста. Селекция микроорганизмов, направленная на увеличение скорости роста, как и любая дрзтая селекция по количественным при накам, представляет собой трудоемкий и длительный процесс. Первым этапом этого процесса является выращивание селектируемой культуры на плотной среде, которая позволяет расти всем жизнеспособным особам данного микроорганизлтс. Отбор более продуктивных мутантов вьшолняется только на втором этапе, заключающемся в ивдивидуальном испытании каждого клона по селектируемому признаку. Несмотря на предварительное воздействие на исхид:гьп1 микроорганизм высокоактивных мутагенов, более продуктивные мутанты встречаются очень редко, их колонии внешне ничем не отличаются, а поэтому для их поиска испытанию подвергаются сотни клонов. jQлитeльнocт И трудоемкость испытаний являются серьeзны ш недостатками, устра1 яемыми лишь в тех редких сл чаях, когда возможно применезше селективных питательных сред на этапе клонирования. Известка питательная среда для выращивания этанол- усваивающих микроорганизмов, содержащая этанол в качестве единственного источника углерода, источники других элементов, в частности, калий фосфорнокислый однозамеще1шый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магш1й сернокислый, а также агар мочевину и воду 1. Однако использова1ше этой питательной среды в селекции этанол-усваивающих микрооргаш1змов не позволяет достаточно эффективно находить наиболее быстро растущие мутантные формы по указанным причинам. Целью изобрете1шя является ускорение процесса селекции и обеспечение возможности отбора наиболее быс7ро растущих мутантов этанолусваивающих. микроорганизмов. Постапленная цель достигается тем, что питательная среда, включающая этанол как един3ственный источник углерода, необходимые ми неральные соли и агар, дополнительно содержит иодуксусную кислоту (ИУК) в качестве . ингибитора алкогольдегидрогеназы (АДГ) в к центрации, достаточной для торможения роста исходного микрооргаьшзма. Входящие в питательную среду компоненты находятся в следу ющем соотнощении, вес.%: 0,7-1,5 Калий фосфорнокислый 0,25-0,3 однозамещенный Натрий фосфорнокислый 0,5-0,6 двузамещенный 0,1-0,13 Магний сернокислый 0,19-0,34 Мочевина 0,1-0,8 Иодуксусная кислота 1,5-2,0 Остальное Предлагаемая среда является селективной и способствует росту только тех клонов исходного микроорганизма, которые обладают повышеньш1ми скоростями роста по сравнени с основной массой клеточной популяции. Введение в среду иодуксусной кислоты в качестве селектирующего агента обусловлен следующими теоретическими предпосылками. К увеличению скорости роста микрооргаьшзм на этанол-содержащих средах должны проводи мутации, способствующие повыщению продук ферментов, катализируюи:1их процессы превращения этанола в органические компоненты клеток, и в первую очередь алкогольдегидрогеназы (АДГ) первого фермента этой цепи процессов. Известно, что иодуксусная кислота является сильн111М ингибитором АДГ, связываясь с сульфгидрильными группами активного центра этого фермента. Действие иодуксусной кислоты, в отличие от ее производных (эфиров, амида), достаточно специфично, т.е. кроме АДГ, эта кислота действует еще на один фермент (участвующий в процессах усвоения Сахаров). На среде, единственным источ1шком углерода в которой является этанол, в присутствии иодуксусной кислоты могут расти лишь такие мутанты, которые производят АДГ в количестве большем, чем данная концентрация иодуксусной кислоты может не активировать. Повышенная продукция АДГ должна обеспечивать этим мутантам более высокую скорость роста на этанол-содержащей среде и в отсутствии ингибитора. Выделенные с помощью предлагаемой среды быстро растущие мутанты этанол-усваивающих дрожжей Candida reguinyi 316 производят значительно больше алкогольдегидрогеназы, чем исходная культура. В табл. 1 представлены величины удельной скорости роста (м) и активности алкогольдегидрогеназы. Таблица 1

Готовят предложенную питательную среду следующим образом.

Входящие в ее состав компоненты, вес.%. КН2РО40,25-0,3

Na2HP04-i2H200,5-0,6

MgSO47H2O0,1-0,13

Мочевину0,19-0,34

Иодуксусную кислоту0,1-0,8

растворяют в Необходимом количестве водопроводной воды, нейтрализуют с помощью NaOH до рК 7,0, добавляют 1,5-2,0 вес.%

агара, стерилизуют а1зтоклаве при 120° С в течение 20 мин, охлаждают до 50-70° С

и добавляют и стерильных условиях 0,71,5-вес.% 96%-ного этилового сгшрта.

Пример I. Селекция микроорганизмов. В качестве селектируемого материала используют суспензию клеток дрожжей Candida reguinyi 316, выращенную культивированием в течеше 16 ч при 28-30° С на жидкой питательной среде след ющего состава, г/л:

этанол 15, КНзРО 3, Na2HP0442H2 0,6, MgS047H20 1,3, мочевина 1,9, водопроводная 57 вода - до 1 л. Для увеличения генетического разнообразия суспензия клеток может быть обработана мутагенами. Затем неразведенную суспензию высевают по 0,1 мл на чашки Петр с предлагаемой питательной средой следующег состава, вес.%: Этиловый спирт КН2Р04 Na2HP04-12H2O MgS04-7H20 Мочевина Иодуксусная кислота Агар Остальное Через четверо суток культивирования при 30°С вырастают колонии устойчивых к иодуксусной кислоте мутантов. Частота их спонта ного возникновения у дрожжей Candida regu- inyi 316 составляет 3, 7-10, а после предварительной обработки мутагеном (0,0025М фанетил-ди-2-хлорэтиламином) - 1,25-10. Коло нии отсевают, очищают рассевом разведенных суспензий на предлагаемой среде. Высевая полученные мутанты в колбы с жидкой питател ной средой указанного состава и измеряя кон

В результате испытания значительно большего числа клонов исходной дрожжевой культуры.

вьщеленных на известной среде (их исследовано 60), не выявлено ни одного клона с велицентрацию биомассы каждого мутанта в процессе культивирования при , вычисляют удельные скорости роста (JU ). Достаточно испытания 10-15 мутантов, выделенных на предлагаемой среде, чтобы найти несколько штаммов, превосходящих исходную культуру по удельной скорости роста. П р и м е р 2. Селекция лшкроорганизмов. Густую суспензию клеток бактерий Aci- netobacter calcoaceticus 34, подготовленную по примеру 1, высевают на чашки с предлагаемой питательной средой, имеющей следующий состав, вес.%: Эт11ловый спирт0,7 KHjP040,3 Ыа2НГО4-12Н20 .0,6 MgSO4-7H200,13 Мочевина0,34 Иодуксусная кислота0,1 Агар2,0 ВодаОстальное Дальше все по примеру 1. В табл. 2 представлены данные по распределению величин JU среди клонов, отобранных на сравниваемых питательных средах. Таблица 2 773 чиной /J ; более 0,35 . В то же время из всех 16 мутантов, выделенных на предлагаемой среде, обнаружено 4 клона (), у которых м выше - 0,35 . Из ЬО клонов бактерий, выделенных на известной среде нет ни одного с величиной д.превышающей 0,50 . Среди 26 клонов тех же бактерий, выделенных на предлагаемой среде, 5 клонов (около 20%) имеют удельные скорости роста выше 0,50 }, в том числе 2 клона, превосходящяе исходную культуру но скорости роста на 77%. При селекции на предлагаемой среде смешаются величины м отобранных клонов в большую сторону. Если для выделенных на известной среде клонов дрожжевой культуры величины м лежат в пределах 0,15-0,35 ч, то у отобранных на предлагаемой питатель1 ой среде клонов - в пределах 0,25-0,40 ч. Среда клонов дрожжей, выделенных на предлагаемой литател 1ГОЙ среде, не обнаружено 1аких,которые имели бы удельную скорость роста i-шже 0,25 ч°, хо тя в исходной культуре дрожжей такие клоны составляют почта половину популятдии. Аналогичная картина наблюдается и при селекщн бактерий. Таким образом, у этанол-усваивающих мик роорганизмов с помопдыо предлагаемой питательной среды возможно селективное выделение муганток, обладающих повышенной скоростью роста в результате увеличении продук дин алкогольдегидрогеназы. Эти мутанты способны на предлагаемой питательной среде образовывать видимые колонии (в отлич1ге от огромного Оольшинства представителей исходной культуры), а при глубинном культивировании на жидкой питательной среде того же состава, но не содержащей ингибитора ЛДГ (и агара), обладают более высокими у.ельными скоростями роста, чем исходная культура. Предлагаемая питательная среда для селекции зтанол-усваювающих микроорганизмов значительно (в десятки раз) ускоряет процесс селекщш и обеспешвает возможность отбора наиболее быстро растущих, а, следовательно, наиболее продутстивных мутантных форм. Формула изобретения Питательная среда для селекции этанолусваивающих микроорганизмов, содержащая этанол в качестве источника углерода, калий фосфорнокислый однозамеще1-шьш, натрий фосфорнокислый даузамещенный, магний сернокислый, мочевину, агар и воду, отличающаяся тем,.что, с целью ускорения процесса селекции и возможности отбора наиболее быстро растущих мутантных форм микроорганизмов, она дополнительно содержит иодуксусную кислоту в качестве ингибитора алкогольдегидрогеназы при следующем соотношении компонентов, вес.%; Этанол0,7-1,5 Калий фосфорнокислый одд10замещенный0,25-0,3 Нат1жй фосфорнокислый /даузамещенный0,5-0,6 Mari-шй сернокислый0,1-0,13 Мочевина0,19-0,34 Иодуксусная кислота0,1-0,8 Агар1,5-2,0 ВодаОстальное Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Коваленко С. П. и др. Выделение из природных источш1ков микроорганизмов хорошо растуш;их на некоторых 82 - соединениях. Микробы и их метаболиты, Минск, 1074, с. 126-130.