Способ определения клеточного иммунитета к вирусу гриппа Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к методам диагностики.

Цель изобретения - упрощение способа путем использования в качестве клеток системы фагоцитирующих макрофагов моноцитов периферической крови.

Это достигается тем, что в качестве фагоцитирующих мононуклеаров используют моноциты периферической крови и по увеличению цитотоксической активности лимфоцитов сенсибилизированных лиц определяют клеточный иммунитет к вирусу гриппа.

Пример. Испытуемый доброволец Б. исследован через 21 день после ревакцинации живой противогриппозной вакциной А (Новошахтинск, 1(86). Из локтевой вены шприцем взяли 6 мл крови и перенесли во флакон, содержащий 120 ед. гепарина. Кровь развели до 15 мл питательной средой (среда Игла, содержащая 10% инактивиро- ванной эмбриональной телячьей сыворотки 20 ед/мл гепарина и 100 мкг/мл мономици- на и по 7,5 мл наслаивали на 3 мл градиента

фиколлверогрзфин с плотностью 1,077 г/см3. После центрифугирования (35 мин при 1500 об/мин) взяли интерфазу, содержащую мо- нонуклеарные клетки, отмыли в 10 мл питательной среды,отцентрифугировали 10 мин при 1500 об/мин, осадок развели 10 мл питательной среды и осуществили разделение мононуклеарной суспензии на прилипающие и не прилипающие клетки.

С этой целью суспензию мононуклеар- ных клеток перенесли во флакон для клеточных культур (125 мл). Флакон инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Затем жидкость, содержащую лимфоциты, отбирали и сохраняли при 37°С до использования. Перед применением в качестве эффекторов клеточную суспензию центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин, осадок разводили питательной средой до соответствующей концентрации.

Для снятия прилипших клеток во флакон наливали 6 мл 10 мм раствора ЭДТА, разведенного питательной средой 1/1 и инкубировали 15 мин при 37°С. Далее худ(Л

С

о ю

00

о

00

о

кость сливали, клетки осаждали и дважды промывали питательной средой (режим центрифугирования - 10 мин при 1500 об/мин). Клеточный осадок, содержащий 90% моноцитов, разводили питательной средой и рассеивали в полистироловую 96-луночную круглодонную микроплату по 200 тыс. клеток на лунку в объеме 0,2 мл, всего использовали 15 лунок. Микроплату оставляли на ночь (16 ч) в термостате прм 37°С. Затем клеточный монослой заражали вирусом гриппа A (PR 34 (H1N1), используя стерильную вирусосодержащую аллантоиснуюжид- Kocib (ВАЖ) развивающихся куриных эмбрионов, разведенную до титра гемагг- лютмнина 10 (0,2 мл), Предварительно из лунок с моноцитами удаляли надосадочную жидкость, лунки промывали питательной средой и после отбора последней наносили ВАЖ по 0,2 мл на лунку: После инкубации в течение 1 ч при 37°С ВАЖ удаляли, лунки дважды промывали средой Игла, добавляли по 0, мл питательной среды и продолжали инкубирование при 37°С в течение 4 ч. За- rev, надосадочнуга жидкость удаляли, клет :да промывали средой Игла и добавляли VD-:T,KV - нейтральный красный по 0,2 мл на яу;;-. в очде 0,04Устного раствора в среде Хечи-;з. После инкубации пш 37°С надосадочную жидкость удаляли, клеточный мо- яоолой промывали средой Игла, добавляли питательную среду и инкубировали 1 ч при 37° С.

Затем в 5 лунок после удаления питательной среды добавляли суспензию лимфоцитов - 860 тыс.клеток в объеме 0,2 мл питательной среды нэ лунку (соотношение моноцитов и лимфоцитов 1:4,3), в остальных 10 лунках с моноцитами меняли питательную среду и микроплату оставляли для инкубации прм 37°С в течение 16ч.

После окончания инкубации надосадоч ную жидкость сливали, микроплату дважды

промывали путем погружения в забуференный 0,9%-ный раствор хлористого натрия

(рН 7,2), Нейтральный красный освобожда-

ли из моноцитов добавлением в каждую лунку на 10 мин 0,2 мл 0,05 М раствора уксусной кислоты в 50% этанола. Смесь из лунок отбирали, доводили до объема 1 мл забуфе5 ренным 0,9%-ным раствором хлористого натрия и определяли оптическую плотность на спектрофотометре (СФ-26) при 540 нм против контрольного раствора (0,2 мл 0.05М уксусной кислоты в 50% этаноле + 0, 8 мл

10 забуференного 0,9%-ного раствора хлористого натрия).

Для осуществления способа потребовалось 48 ч.

Оптическая плотность жидкости из 10

15 лунок с моноцитами равнялась в среднем 0,08±0,02. Оптическая плотность жидкости из 5 лунок, содержащих моноциты и лимфоциты, равнялась 0,03 ± 0,01. Различие статистически достоверно (Р 0,05). Лизис

20 моноцитов 63%.

При исследовании цитотоксической активности лимфоцитов крови данн,оге золои- тера в периоде до вакцинации и через 8 дней после вакцинации лизис-моноцитов 25 составил соответственно 9 и 3%.

Результаты исследования свидетельствовали о повышении цитотоксмческой активности лимфоцитов вакцинированных лиц к моноцитам, инфицированным виру30 сом гриппа, формировании у них клеточного иммунитета.

Формула изобретения Способ определения клеточного иммунитета к вирусу гриппа по цитотоксическому

35 поражению иммунными лимфоцитами клеток системы фагоцитирующих мононуклеа- ров, зараженных вирусом, отличающии- с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве фагоцитирующих мононуклеаров

40 используют моноциты периферической крови и при увеличении цитотоксичеекой активности лимфоцитов сенсибилизированных лиц определяют клеточный иммунитет к вирусу гриппа.

45

Изобретение относится к методам диагностики. Целью изобретения является упрощение способа. Это достигается тем, что в способе определения клеточного иммунитета к вирусу группа по цитотоксическому поражению иммунными менфоцитами клеток системы фагоцитирующих менонуклеар з, зараженных вирусом, в качестве фагоцитирующих мононуКлеаров используют моноциты периферической крови и при увеличении иитотоксической активности лимфоцитов сенсибилизированных лиц определяют клеточный иммунитет к вирусу группа.