Способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-COV-2 Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 G01N33/53 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета.

Изобретение может быть использовано в медицине для определения специфического клеточного иммунного ответа к N-белку вируса SARS-COV-2 и его количественной оценки у переболевших COVID-19 и привитых от этой инфекции людей.

Оценка гуморального иммунитета к антигенам вируса SARS-CoV-2 не является проблемой на данном этапе, поскольку имеется достаточное количество тест-систем, с помощью которых можно количественно оценить уровень антител разных классов как к S-белку, так и к N-белку вируса SARS-CoV-2. Известно, что именно эти белки у данного вируса являются наиболее иммуногенными. При этом антитела к S-белку являются протективными, тогда как антитела к N-белку рассматриваются как антитела-свидетели, подтверждающие перенесенную инфекцию, но не защищающие от инфицирования, т.к. N-белок находится внутри вириона и антитела к нему не могут помешать вирусу инфицировать клетку хозяина. Увлечение разработчиков тест-систем S-белком оставляло N-белок в тени, тогда как он высоко консервативен среди коронавирусов и является одним из наиболее распространенных структурных белков в инфицированных вирусом клетках.

Иначе обстоят дела с формированием протективного клеточного иммунитета. Специфические CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты распознают антигенные вирусные пептиды в комплексе HLA-I, выставленные на поверхности зараженной вирусом клетки. При этом совершенно неважно, из каких именно белков вируса были нарезаны эти пептиды. Главное, чтобы это были чужеродные пептиды, специфичные для данного вируса. При распознавании комплекса HLA-I-вирусный пептид цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты активируются и выбрасывают в сторону зараженной вирусом клетки содержимое своих цитотоксических гранул, содержащих перфорин, гранзимы и другие биологически активные вещества, индуцирующие апоптоз зараженной клетки. В результате вместе с зараженной клеткой погибают и синтезируемые внутри нее вирусы. Для того чтобы эти биологически активные вещества не повредили сам цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, на внутренней поверхности цитотоксических гранул имеется молекула CD107a, стабилизирующая мембрану. В момент, когда цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит распознал зараженную вирусом клетки и атакует ее, мембрана цитотоксических гранул сливается с внешней мембраной CD8+ лимфоцита, содержимое гранул воздействует на зараженную вирусом клетку, а на поверхности CD8+ Т-лимфоцита экспрессируется молекула CD107a. Используя меченные флуорохромом моноклональные антитела к этой молекуле, можно посчитать процент CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов, распознавших конкретный антиген и ответивших атакой на такое распознавание.

Классическим методом определения клеточного иммунитета считают метод ELISpot. Следует отметить, что имеются тест-наборы, разработанные для этого метода, в которых стимуляцию лимфоцитов осуществляют смесью антигенных пептидов из S- и N-белка вируса SARS-COV-2 [1]. Недостатком этого метода, как и других методов, основанных на продукции IFN-γ [2], является то, что IFN-γ синтезируют различные субпопуляции лимфоцитов, такие как NK-, NKT-, CD8+, Thl, и даже γδ-Т клетки, поэтому при оценке методом ELISpot получаются суммарные результаты, из которых невозможно вычленить вклад именно CD8+ цитотоксических лимфоцитов. Есть методы, позволяющие выделить только CD8+ клетки, но для этого требуется большой объем крови (около 20 мл) и дополнительные дорогостоящие импортные реактивы. При этом следует подчеркнуть, что сам IFN-γ не оказывает прямого воздействия на вирус, а лишь организует противовирусный иммунный ответ, поэтому может лишь косвенно свидетельствовать о наличии клеточного цитотоксического иммунитета.

Учитывая высокую степень консервативности N-белка, поскольку он почти не мутирует, и тот факт, что он является репрезентативным антигеном для Т-клеточного ответа, разработка метода оценки Т-клеточного иммунитета является весьма актуальной. Было показано, что Т-клеточные ответы, сформировавшиеся на вирус SARS-CoV-1 сохранялись многие годы [3]. При этом были выявлены перекрестные эпитопы между SARS-CoV-2 и другими коронавирусами человека.

В качестве аналога предлагаемого изобретения можно рассмотреть статью O.-W. Ng et al. [4], в которой исследовали клеточный иммунитет к первому вирусу SARS-CoV-1, эпидемия которого произошла в Китае в 2003 г. При этом клеточный иммунитет сохранялся более 10 лет, а гуморальный исчез спустя 3 года. В данной работе стимуляцию клеточного иммунитета проводили синтетическими пептидами, аналогичными по структуре пептидам различных белков вируса SARS-CoV-1. Недостатком такого способа стимуляции является то, что CD8+ распознают антигенный пептид в комплексе с HLA, а эта молекула весьма гетерогенна в популяции людей и конкретный пептид может хорошо встраиваться в один вариант HLA и не встраиваться в другой. Поэтому результаты могут различаться у разных людей не только в зависимости от наличия или отсутствия CD8+ клеток, способных распознавать конкретный пептид, но и от различий в HLA, способной презентировать данный пептид.

В качестве прототипа выбран патент РФ № 2762616 [5].

Способ предусматривает, что выделенные из крови пациента мононуклеары инкубируют в присутствии 10 мкМ моненсина, меченных флюорохромом моноклональных антител к антигену CD107a в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки в течение 20 часов при 37°С в атмосфере 5% CO₂ и 100% влажности в лунках 96-луночного планшета в качестве контрольной пробы и в лунках 96-луночного планшета от набора для определения антител к S-белку вируса SARS-COV-2 методом ИФА, в которых на дно лунок сорбирован полноразмерный S-белок, в качестве опытной пробы; затем осуществляют последующее окрашивание лимфоцитов меченными флюорохромом антителами к CD8 и регистрацию на проточном цитофлюорометре процента субпопуляции дважды позитивных Т-лимфоцитов CD8^hiqhCD107a⁺ в контрольной и опытной пробе. Различия состоят в том, что в указанном патенте стимуляцию лимфоцитов проводили S-белком вируса SARS-CoV-2, а в заявленном способе использован N-белок вируса SARS-CoV-2.

Технической проблемой, решаемой изобретением, является разработка простого и удобного способа определения и оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-COV-2, позволяющего количественно определять специфический клеточный компонент иммунного ответа на этот вирус.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и оценки специфического клеточного иммунного ответа на N-белок коронавируса SARS-COV-2 на основании экспрессии молекул CD107a на поверхности распознавших антигены N-белка коронавируса SARS-COV-2 CD8+ цитотокических Т-лимфоцитов, определяемой методом проточной цитометрии.

В предварительных исследованиях была изучена возможность стимулировать выделенные из периферической крови мононуклеары с помощью N-белка, сорбированного на дне лунок 96-луночного планшета от набора для определения антител к N-белку вируса SARS-COV-2 методом ИФА. Показано, что N-белок, сорбированный на дне лунок тест-системы «N-CoV-2-IgG PS» (ФБУН НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург, РФ) эффективно стимулирует CD8+ T-лимфоциты у переболевших COVID-19. Оптимальное время инкубации мононуклеаров с антигеном составило 20 часов.

Технический результат изобретения заключается в том, что заявленный способ определения и оценки специфического клеточного иммунного ответа на N-белок вируса SARS-COV-2, осуществляемый на основании детекции экспрессии CD107a на поверхности распознавших антигены N-белка вируса SARS-COV-2 CD8+ Т-лимфоцитов, позволяет количественно определить клеточный компонент иммунной защиты против вируса SARS-COV-2. При этом преимущество разработанного способа оценки клеточного иммунного ответа на N-белок вируса SARS-CoV-2 состоит в том, что в отличие от S-белка, N-белок практически не подвергается мутациям. Метод позволяет различить перенесших COVID-19 и привитых вакциной, содержащей только S-антигены вируса SARS-CoV-2 (например, «Спутник V»), а также исследовать клеточный иммунитет у привитых вакциной, содержащей N-белок этого вируса (например Конвасэл). В комплексе с рутинной оценкой антител к вирусу SARS-CoV-2 предложенный метод позволяет оценить наличие иммунной защиты против этого вируса. Предложенный метод позволяет измерить процент именно цитотоксических Т-лимфоцитов, специфически распознающих N-белок коронавируса и атакующих зараженные вирусом SARS-CoV-2 клетки, независимо от мутаций, происходящих в S-белке этого вируса.

Данный способ позволяет с чувствительностью 100% и специфичностью 94,74% выявлять клеточный иммунный ответ на антигены N-белка вируса SARS-CoV-2.

Сущность изобретения заключается в следующем:

Для выявления специфического клеточного иммунитета к N-белку вируса SARS-CoV-2 были сформированы 2 группы по 20 человек. Группу 1 составили люди, переболевшие COVID-19, имевшие подтверждение диагноза методом ПЦР, давность заболевания составила 3-12 мес. Группу сравнения 2 составили люди, привитые вакциной Спутник V и не болевшие COVID-19. Следует подчеркнуть, что пандемия COVID-19, продолжавшаяся более 3-х лет и сопровождавшаяся неоднократными подъемами заболеваемости, связанными с частыми мутациями в S-белке коронавируса, привела к тому, что на данный момент практически не осталось людей, так или иначе, не знакомых с этим вирусом. Привитые вакциной Спутник V и не болевшие этой инфекцией имеют иммунитет к S-белку коронавируса, но не имеют иммунитета к N-белку, поскольку этот белок не входит в состав вакцины. Поэтому такие люди были отнесены в группу сравнения.

Венозную кровь для исследования отбирали в вакуумные пробирки с напылением гепарина. Выделение фракции мононуклеаров осуществляли методом градиентного центрифугирования в стерильных условиях и отмывали центрифугированием в среде RPMI-1640 при 600g 10 мин. Надосадок удаляли, а к мононуклеарам добавляли 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глютамина, гентамицин и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Для контрольной пробы в лунку стерильного плоскодонного 96-луночного планшета вносили суспензию мононуклеаров (3×10⁵ на лунку), раствор моненсина в конечной концентрации 10 мкМ и моноклональные антитела к антигену CD107a-PE-Cy5 в конечном разведении 1:100. Для опытной пробы использовали лунки 96-луночного планшета от набора для определения антител к N-белку вируса SARS-COV-2 методом ИФА, в которых на дне лунок был сорбирован N-белок коронавируса, согласно инструкции производителя. Был использован набор «N-CoV-2-IgG PS» (ФБУН НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург, РФ). Перед внесением суспензии мононуклеаров лунки из набора для ИФА были простерилизованы с помощью ультрафиолетового облучения в стерильных условиях в течение 30 минут. Далее вносили суспензию клеток, раствор моненсина и антитела, так же и в тех же количествах, что и в контрольной пробе. Затем пробы инкубировали 20 часов во влажной атмосфере и 5% СО₂ при 37°С. После инкубации клетки ресуспендировали, переносили в пробирки типа эппендорф и отмывали центрифугированием (300g 3 мин) в забуференном фосфатами физиологическом растворе с добавлением 0,02% азида натрия и 0,02% Na₂-ЭДТА. Надосадок удаляли, а клетки окрашивали антителами к антигену CD8-FITC при 4°С 20 минут в темноте, затем повторно отмывали центрифугированием при тех же условиях, добавляли CellWash раствор для цитометрии и ресуспендировали. Полученную суспензию клеток анализировали с помощью проточного цитометра BD FACS Canto II (технологии и программное обеспечение Becton Dickinson, США). Следует отметить, что для такого анализа подходит любой цитометр любой фирмы. В каждой пробе подсчитывали 50000 клеток. В процессе анализа выделяли лимфоидный гейт (G1), в нем в режиме FITC-SSS выделяли гейт лимфоцитов, высоко экспрессирующих антиген CD8 (CD8^high) - это субпопуляция цитотоксических Т-лимфоцитов (G2). И уже в гейте G2 на графике CD107a-PE-Cy5 против CD8-FITC регистрировали облако дважды положительных клеток. Полученное число отражает процент цитотоксических лимфоцитов, распознавших антигены N-белка вируса SARS-CoV-2 относительно общего количества CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов. Затем из результата, полученного в опытной лунке (уровень дегрануляции, индуцированной N-белком) вычитали результат, полученный в контрольной лунке (уровень спонтанной дегрануляции).

Для выяснения информативности разработанного нами метода оценки специфического клеточного ответа на N-белок вируса SARS-CoV-2 провели ROC-анализ полученных данных - метод построения операционных характеристических кривых (Receiver Operating Characteristic curve, сокращенно ROC-кривых), позволяющих оценить диагностическую эффективность метода. Была выявлена высокая вероятность разделения группы переболевших COVID-19, имевших ответ на N-белок коронавируса и группы сравнения, привитых вакциной «Спутник V», в которой содержится только S-белок, но не N-белок вируса SARS-CoV-2. Площадь под ROC-кривой (AUC) составила 0,997 (0,989-1,006), (р<0,05). (Фиг. 1.)

Затем был произведен расчет уровня порогового значения (cut off) для критерия экспрессии антигена CD107a на CD8high T-лимфоцитах в ответ на индукцию антигенами N-белка вируса SARS-CoV-2 за вычетом показателя спонтанной экспрессии этого антигена. В результате был получен уровень cut-off=1,115%, который с чувствительностью 100% и специфичностью 94,74% позволяет выявить специфический клеточный иммунитет на антигены N-белка вируса SARS-CoV-2.

Таким образом, если у обследуемого человека рассчитанный критерий (процент экспрессии антигена CD107a на CD8high Т-лимфоцитах в ответ на индукцию антигенами N-белка вируса SARS-CoV-2 за вычетом спонтанной экспрессии этого антигена) превышает уровень cut off (1,115%), то данный человек имеет специфический клеточный иммунитет на антигены N-белка вируса SARS-CoV-2. Чем больше полученное число, тем выше клеточный иммунитет к N-белку коронавируса. Дополнительным критерием правильности выполненного теста является то, что уровень спонтанной экспрессии антигена CD107a на CD8high Т-лимфоцитах не превышает 1%.

Осуществление способа изобретения поясняется на следующем примере.

Пример. В качестве примера в таблице 1 приведены результаты измерения уровней экспрессии антигена CD107a на CD8high Т-лимфоцитах (спонтанный и индуцированный антигенами N-белка вируса SARS-CoV-2) у случайно выбранных 10-и человек с неизвестным анамнезом относительно контактов с вирусом SARS-CoV-2. Во всех приведенных случаях спонтанный уровень экспрессии антигена CD107a на CD8high Т-лимфоцитах не превышает 1%, что свидетельствует о правильности проведенной оценки.

Используя значение порогового критерия 1,115% для оценки полученной разницы между индуцированной и спонтанной экспрессией антигена CD107a на CD8^high Т-лимфоцитах (правая колонка таблицы), находим, что пациенты под номером 1, 2, 3, 4, 6,8,9 и 10 имеют значения этого показателя выше значения cut off, что свидетельствует о наличии специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2. Важно, что чем выше полученное значение рассчитанного показателя (правая колонка таблицы), тем более выражен специфический клеточный иммунитет к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2. Например, у людей под номером 2 и 10 обнаружен положительный, но невысокий уровень клеточного иммунитета к N-белку вируса SARS-CoV-2, у людей под номером 3,4 и 8 - высокий уровень, а у людей под номером 1,6 и 9 - средний уровень такого ответа. Интересно, что у людей под номером 5 и 7 рассчитанный показатель оказался ниже значения cut off=1,115%, что говорит об отсутствии у данных людей специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2.

Таким образом, используя предложенный нами способ, по разнице между уровнем индуцированной антигенами N-белка вируса SARS-CoV-2 экспрессии антигена CD107a на CD8^high Т-лимфоцитах и уровнем спонтанной экспрессии антигена CD107a, можно выявлять наличие и количественно оценивать специфический клеточный иммунитет к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2. Рассчитанный пороговый критерий (cut off=1,115%) позволяет с чувствительностью 100% и специфичностью 94,74% разделять людей имеющих и не имеющих специфический клеточный иммунитет к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2. Метод прост в исполнении и позволяет получать количественные результаты на следующий день после взятия крови на анализ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Titov A., Shaykhutdinova R., Shcherbakova O.V., Serdyuk Y.V., Sheetikov S.A., Zornikova K.V., Maleeva A.V., Khmelevskaya A., Dianov D.V., Shakirova N.T., Malko D.B., Shkurnikov M., Nersisyan S., Tonevitsky A., Khamaganova E., Ershov A.V., Osipova E.Y., Nikolaev R.V., Pershin D.E., Vedmedskia V.A., Maschan M., Ginanova V.R., Efimov G.A. Immunogenic epitope panel for accurate detection of non-cross-reactive T cell response to SARS-CoV-2. JCI Insight, 2022, Vol. 7(9):e157699. doi: 10.1172/jci.insight.l57699

2. Wang F., Hou H, Luo Y., Tang G., Wu S., Huang M, Liu W., Zhu Y, Lin Q., Mao L., Fang M., Zhang H., Sun Z. The laboratory tests and host immunity of COVID-19 patients with different severity of illness. JCI Insight. 2020;5(10):e137799. https://doi.org/10.1172/jci.insight.137799.

3. Le Bert, N., Tan, A.T., Kunasegaran, K., Tham, C.Y.L., Hafezi, M., Chia, A., Chng, M.H.Y., Lin, M., Tan, N., Linster, M., Chia, W.N., Chen, M.C., Wang, L.-F., Ooi, E.E., Kalimuddin, S., Tambyah, P.A., Low, J.G.-H., Tan, Y.-J., Bertoletti, A. (2020) SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls, Nature, 584, 457-462. doi: 10.1038/s41586-020-2550-z

4. Ng, O.W., Chia, A., Tan, A.T., Jadi, R.S., Leong, H.N., Bertoletti, A., and Tan, Y.J. (2016) Memory T cell responses targeting the SARS coronavirus persist up to 11 years post-infection, Vaccine, 34, 2008-2014. doi: 10.1016/j.vaccine.2016.02.063

5. Патент RU 2762616 C1 Российской Федерации СПК G01N 33/533 (2021.08); G01N 33/577 (2021.08); A61B 5/145 (2021.08) Способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам S-белка вируса SARS-CoV-2 / А.П. Топтыгина; заявитель и патентообладатель ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (RU), заявл. 22.09.2021, опубл. 21.12.2021 Бюл. №36 -, 12 с.: с ил.

Изобретение относится к области иммунологии. Описан способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2. Технический результат заключается в разработке простого и удобного способа определения и оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-COV-2, позволяющего количественно определять специфический клеточный компонент иммунного ответа на этот вирус. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2, характеризующийся тем, что последовательно выполняют следующие этапы:

- из венозной крови пациентов методом градиентного центрифугирования выделяют фракцию мононуклеаров;

- отмывают центрифугированием в среде RPMI-1640 при 600g 10 мин;

- надосадок удаляют и к мононуклеарам добавляют 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глютамина, гентамицин и 10% эмбриональной телячьей сыворотки;

- в качестве контрольной пробы в лунку стерильного плоскодонного 96-луночного планшета вносят 3х10⁵ суспензию мононуклеаров, раствор моненсина в конечной концентрации 10 мкМ и моноклональные антитела к антигену CD107a-PE-Cy5 в конечном разведении 1:100;

- для опытной пробы используют лунки 96-луночного планшета от набора для определения антител к N-белку вируса SARS-COV-2 методом ИФА, в которых на дне лунок сорбирован N-белок коронавируса;

- перед внесением суспензии мононуклеаров лунки из набора для ИФА стерилизуют с помощью УФ-облучения в стерильных условиях в течение 30 мин;

- вносят суспензию клеток, раствор моненсина и антитела в тех же количествах, что и в контрольной пробе;

- пробы инкубируют 20 ч во влажной атмосфере и 5% CO₂ при 37°С;

- после инкубации клетки ресуспендируют, переносят в пробирки типа эппендорф, отмывают центрифугированием при 300g 3 мин в забуференном фосфатами физиологическом растворе с добавлением 0,02% азида натрия и 0,02% Na₂-ЭДТА и надосадок удаляют;

- клетки окрашивают антителами к антигену CD8-FITC при 4°С в течение 20 мин в темноте, затем повторно отмывают центрифугированием при тех же условиях, добавляют CellWash раствор для цитометрии и ресуспендируют;

- полученную суспензию клеток анализируют с помощью проточного цитометра, где в каждой пробе подсчитывают 50000 клеток;

- в процессе анализа выделяют лимфоидный гейт - G1, а в нем в режиме FITC-SSS выделяют гейт лимфоцитов, высокоэкспрессирующих антиген CD8 (CD8^high) - гейт G2;

- в гейте G2 на графике CD107a-PE-Cy5 против CD8-FITC регистрируют облако дважды положительных клеток, где полученное число отражает процент цитотоксических лимфоцитов, распознавших антигены N-белка вируса SARS-CoV-2 относительно общего количества CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов;

- затем из результата, полученного в опытной пробе, обозначающего уровень дегрануляции, индуцированной N-белком, вычитают результат, полученный в контрольной пробе, представляющий собой уровень спонтанной дегрануляции, и полученную разницу сравнивают с рассчитанным значением cut off, равным 1,115%;

- если полученная разница у пациента превышает 1,115%, это свидетельствует о наличии у него специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2 в количестве, равном полученной разнице, а если разница составляет менее 1,115%, это свидетельствует об отсутствии у пациента специфического клеточного иммунитета к антигенам N белка вируса SARS-CoV-2.