Способ размножения гречихи IN VIтRо Советский патент 1992 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции растений при массовом размножении ценных экземпляров, в исследованиях по физиологии, генетике растений.

Цель изобретения - сохранение высокой регенерационной способности кал- луской ткани при длительном субкультиви- ровзнии.

Поставленная цель достигается тем. что в способе размножения гречихи In vitro,, включающем вычленение эксплантатов, культивирование их на питательной среде до получения первичной каллусной ткани и последующей пересадке ее на питательную среду для индукции органогенеза и получение растений-регенерантов, в качестве эксплантатов вычленяют незрелые зародыши

размером 0,5-3,0 мм, которые культивируют до получения первичной каллусной ткани в течение 40-60 дней, при этом культивирование эксплантатов и субкультивирование каллусной ткани осуществляют на питательной среде Гамбурга В 5, мг/л: NaH2P04150 КМОз 2500 (МНфРСМ 134 MgS04 7Н20 250 CaCla 2Н20 150 НзВОз 3.0 MnS04 Н20 10,0 CoCla 6Н20 0,025 СиЗОд Н20 0,025 ZnSCU 7H20 2,0 Na2Mo4 2Н20 0.25 KJ 0.75 FeS04 7H20 28.0 Тиамин-HCI 10,0 Пиридоксин-HCI 1,0 Никотиновая кислота 1.0 Мезоинозит 100 2,4-Д 2.0 Сэхароэа 20 000 для субкультивирования отбирают первичную каллусную ткань, представленную плотными глобулярными образованиями белого, светло-желтого цвета или мягкими комочками серого или светло-коричневого цвета, включающими блестящие плотные структуры белого или желтого цвета.

Способ осуществляют следующим образом.

Плоды гречихи через 4-13 дней после опыления обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом в течение 0,5-3 мин (в зависимости от возраста зародыша) и затем 3-10 мин, в 0,1%-ном растворе диацида с последующим трехкратным промыванием стерильной дистиллированной водой. Зародыш длиной 0,5-3 мм вычленяют в асептических условиях препэровальными иглами и помещают на каллусогенную среду. Инкубируют 40-80 сут в темноте при 25±2°С в чашках Петри. В течение этого времени на эксплантатах формируется первичный каллус и возможен отбор различных морфологических типов каллуса, поскольку ранее 40 дней определенные морфотипы каллусов еще не выявляются, а позже 10 дней начинается некроз тканей и выход каллусов с высокой морфогенной способностью снижается (табл. 1).

/

Исследования показывают, что в культуре каллусных тканей гречихи существует тесная связь между источником эксплантата (зародыш определенной длины), морфологией каллусных культур и способностью этих культур к регенерации.

Каллусы культурной гречихи (фиг. 1) согласно их морфологическим и гистологическим характеристикам могут быть условно разделены на 4 основных типа (А - гетерогенный, В - глобулярный, С - рыхлый. Д - плотноглобулярный). Как видно из фиг. 1, гетерогенные и плотно-глобулярные культу0 ры обладают наиболее высокой почкообра- зующей активностью. Однако для гетерогенных каллусов культурной гречихи характерна морфологическая нестабильность: с увеличением времени культивиро5 вания прогрессирует распад культуры на новые морфологические типы и, как следствие, переход ее в разряд глобулярных или рыхлых культур. Кроме того, органогенез в гетерогенных каллусах культурной гречихи

0 часто сопровождается появлением аномалий морфогенеза (образование антоциансо- держащих листоподобкых выростов, появление нитевидных светло-зеленых побегов, напоминающих мох).

5 В отличие от гетерогенных каллусоо абсолютное большинство плотно-глобулярных каллусов (8 из 9) в течение года сохраняет типичную морфологию и при переводе на органогенную среду формирует

0 почки. Другие типы каллусов - глобулярные, распадающиеся при культивировании на отдельные, не связанные между собой глобулы, образуют на органогенной среде корни и очень редко почки: рыхлые культуры либо

5 совсем не способны к органогенезу, либо образуют отдельные корни.

Вследствие того, что гетерогенные каллусы не являются морфологически стабильными, а глобулярные и рыхлые, хотя и

0 сохраняют морфологические особенности в течение длительного времени культивирования, однако не способны к почкообрззо- ванию, целесообразно использование каллусов плотно-глобулярного типа для ре5 генерации растений культурной гречихи.

У татарской гречихи два типа каллусных культур, различающихся по морфологии: гетерогенные каллусы и гетерогенные каллусы с блестящими структурами белого или

0 желтого цвета. Первый тип каллуса - корне- образующий, второй при переводе на органогенную среду активно формирует почки. Морфологические характеристики и способность к регенерации у гетерогенных культур

5 с плотными структурами сохраняется в течение 18 мес. и более.

Таким образом, для сохранения высокой регенерационной способности каллусов при их длительном культивировании необходимо провести отбор каллусов определенного морфотипа -плотно-глобулярных (табл. 2, 1 морфотип) или гетерогенных с блестящими плотными структурами белого или желтого цвета (морфотип 2).

Как видно из табл. 2 (вариант 8), выход таких каллусов коррелирует с возрастом зародыша, они возникают только на зародышах 0,5-3 мм длины в случае культурной гречихи и на зародышах 0,5-2 мм длины в случае татарской гречихи.

Вследствие того, что описанные типы каллусов сохраняют стабильную морфологию и высокую регенерационную способность, по крайней мере в течение 18ч (табл. 3), то для последующего субкультивирова- ния отбирают только такие морфотипы каллусов.

Пересаживают культуры каждые 25-40 дней, для индукции и поддержания используют среду Гамбурга В 5, дополнительно содержащую, мг/л: никотиновую кислоту 0,1-0,5; бакто-агар 7000-8000; и гидролизат казеин 1500-2000; ИУКО,1-0,5; НУКО.3-0,5; кинетин 0,2-0.4.

Как видно из табл. 4, эта среда является наиболее оптимальной. Уменьшение концентрации перечисленных компонентов (вариант среды 1) снижает скорость роста каллусных культур и способствует формированию каллусов глобулярного типа. Концен- трации компонентов сверх оптимальных (вариант 4) способствует образованию корней и увеличению выхода рыхлых каллусов. Глобулярные и рыхлые культуры (фиг. 1) не способны к формированию почек.

Использование исходной среды Гамбурга В 5 для поддержания каллусов гречихи с высокими морфогенетическими потенциями является неприемлемым. На этой среде можно индуцировать появление различных типов каллусов, в т.ч. и плотно- глобулярных, однако поддерживать дальнейший рост каллусов этого морфотипа не удается: после 1-2 х пассажей на исходной среде Гамбурга В 5 каллусы приобретают темно-коричневую окраску. Морфорлогиче- ски каллус представлен многочисленными глобулярными образованиями. Гистологический анализ таких каллусов выявил их специфичную организацию: в центре от- дельной глобулы находится меристематиче- ская зона, окруженная сверху обкладкой из крупных клеток паренхимного типа.

Такой тип каллуса на среде Гамбурга В 5 (без модификаций) можно было поддержи- вать не менее года, однако он отличается медленным ростом и на регенерационной среде формирует только корни.

При выращивании каллусов на исходной среде Гамбурга В 5 идет селекция определенных типов тканей, не позволяющая поддерживать рост каллусов с высокими морфогенетическими потенциями (способных образовывать почки),

Почкообразование получают на питательной среде Гамбурга В 5, содержащей в качестве фитогормонов 1-2.5 мг/л БАП и 0,1-0,2 мг/л ИУК. Через 1,5-3 недели после пересадки каллусных культур на органогенную среду отмечают массовое появление стеблевых почек. С целью получения необходимого объема однородного материала почки размножают путем индукции адвентивных побегов с использованием среды для регенерации или среды с пониженным содержанием БАП или зеатина (1-0,5 мг/л). Использование последней среды в пассаже, предшествующем пересадке регенеранта на укоренение, способствует вытягиванию стебля, что облегчает выделение единичного побега из клона почек и укоренение его на агаре. Через 5-6 дней после высаживания на среду корнеобразования у растеньиц появляются первые корни, через 2-2,5 недели регенеранты имеют 4-5 листьев и готовы к пересадке в почку. Укорененные растения - регенеранты 5-6 см высоты высаживают в бумажные стаканчики под стеклянный колпак, в течение 1-1,5 недель растения закаливают, постепенно увеличивая продолжительность нахождения на открытом воздухе, после его переносят в условия теплицы или вегетационного домика и выра- щивают до полного созревания семян. При получении и культивировании каллусов Fagopyrum esculentum и Fagopyrum tatarlcum описанным способом высокая ре- генерационная способность каллусных культур сохраняется по крайней мере в течение 18 мес.

Способ оп робирован на двух видах гречихи: культурной (сорт Казанская крупнозерная) и татарской (К-17). Использование предлагаемого способа позволяет проводить ускоренное размножение уникальных генотипов гречихи, а также увеличить выход растений - регенерантов гречихи с широким спектром изменчивости вследствие сохранения высокой регенерационной способности каллусов при длительном их культивировании.

Формула изобретения

Способ размножения гречихи In vitro, включающий вычленение эксплантатов, культивирование их на питательной среде до получения первичной каллусной ткани, субкультивирование первичной каллусной ткани и последующую пересадку ее на питательную среду для индукции органогенеза и получения растений-регенерантов, о т л и чающийся тем, что, с целью сохранения высокой регенерационной способности кал- лусной ткани при длительном субкультивировании, в качестве эксплантатов вычленяют незрелые зародыши размером 0,5-3,0 мм, которые культивируют до получения первичной каллусной ткани в течение 40-60 дней, при этом культивирование эксплантатов и субкультивирование каллусной ткани осуществляют на питательной среде Гамборга В 5, в которой содержится 0,1-0,5 мг/л никотиновой кисло

ты, и дополнительно вводят в нее 1500 2000 мг/л гидролизата казеина, 0,1 -0,5 мг/л ИУК, 0,3-0,5 мг/л НУК, 0.2-0,4 мг/л кинетина и 7000-8000 мг/л бакто-агара, причем для субкультивирования отбирают первичную каллусную ткань, представленную плотными глобулярными образованиями белого, светло-желтого цвета или мягкими комочками серого или светло-коричневого цвета, включающими блестящие плотные структуры белого или желтого цвета. Таблица 1

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции растений при массовом размножении ценных экземпляров, в исследованиях по физиологии, генетике растений. Целью изобретения является сохранение высокой ре- генерационной способности каллусной ткани при длительном субкультивировании. В способе размножения гречихи In vitro, включающем вычленение эксплантатов, культивирование их на питательной среде до получения первичной каллусной ткани и последующую пересадку ее на питательную среду для индукции органогенеза и получения растений-регенерантов. в качестве эксплантатов вычленяют незрелые зародыши размером 0,5-3,0 мм, которые культивируют до получения первичной каллусной ткани в течение 40-60дней, при этом культивирование эксплантатов и субкультивировэние каллусной ткани осуществляют на питательной среде Гамбурга В 5. содержащей мг/л: никотиновая кислота 0,1 -0,5 и дополнительно бакто-агар 7000-8000: гидролизат казеина 1500-2000; ИУК 0,1-0.5; НУК 0,3-0.5, кинетин 0,2-0,4. При этом для субкультивирования отбирают первичную каллусную ткань, представленную плотными глобулярными образованиями белого, светло-желтого цветов или мягкими комочками серого или светло-коричневого цвета, включающими блестящие плотные структуры белого или желтого цвета. Изобретение позволяет сохранить высокую регенерационную способность каллусных культур в течение 18 мес. При этом выход регенерантов на 1 г каллусной ткани на культурной гречихе составляет 3,5 шт., а татарской гречихе 23,0 шт. 3 табл., 1 ил. со VJ О vj ел

Влияние продолжительности культивирования эксплантатов на выход Д-каллусов

Зависимость выхода каллусов определенного типа от длины зародыша

Таблица 2

- указаны варьируемые компоненты, в качестве основы (п.5) взята питательная среда Гамбурга В 5.

Таблица 3

Таблице 4

Нол- во наллусных ли/шй

юV

5В С

12 Продолжатель пасть культивирования