Способ определения биологической активности сульфаниламидов Советский патент 1992 года по МПК G09B23/28 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно, к фармакологии.

Цель изобретзния - повышение точности и определения.

Способ осуществляют следующим образом.

Выясняют тип ацетилирования у обследуемой группы кроликов с помощью нагрузки сульфадимезином. Готовят раствор сульфадимезина 0,5 г и в 100 мл дистилли- рованной воды (0,018 М раствор). Взвешивают 500 мг сульфадимезина переносят в колбу на 100 мл, добавляют небольшое количество дистиллированной воды, перемешивают, для полной растворимости добавляют по каплям 1,0 н. и 0,1 н. раствор щелочи NaOH и после растворения сульфадимезина раствор нейтрализуют до рН 7,0- 7,5 1,0 н. и 0,1 н. раствором соляной кислоты. Объем доводят до 100 мл дистиллированной водой.

Перед обследованием кролика взвешивают. Раствор сульфадимезина 0.50 г/100 мл вводят внутрибрюшинно с учетом веса животного 20 мг на 1 кг (4 мл раствора). Через 1 ч после введения сульфадимезина берут кровь из ушной вены уха в количестве нескольких капель (0.075-0,15 мл) на фильтровальную бумагу в квадрат размером 25x25 мм. Кровь должна пропитывать фильтровальную бумагу. После этого кровь высушивают на воздухе при комнатной температуре. Непосредственно перед определением вырезают квадрат 25x25 мм, содержащий высушенную пробу. Измельчают его ножницами, помещают в центрифуж- ную пробирку, добавляют 0,5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения белков, тщательно перемешивают стеклянной палочкой, добавляют 1,5 мл дистиллированной воды. Проба стоит 15-20 мин, в течение которых ее несколько раз перемешивают для полного извлечения

ел

С

vj о

ь.

ел

го

сульфадимезина в раствор. Далее пробу центрифугируют 20-30 мин при 3000 об./мин. Полученный центрифугат разливают по 0,5 мл в две пробирки с размером внутреннего диаметра 10 мм и высотой 120 мм. К 0.5 мл центрифугата в каждую из двух пробирок прибавляют по 0.1 мл 4 н.соляной кислоты, перемешивают встряхиванием. Одну из двух пробирок плотно закрывают фольгой и ставят гидролизоваться на 45 мин и кипящую водяную баню (100°С).

В гидролизованной пробе определяют общий сульфадимизин, т.е. ацетилирован- ный и свободный вместе, а в пробе, которую не подвергают гидролизу - свободный суль- фадимезин. Далее обе пробы гидролизован- ную и негидролизованную ставят в холодильник при 4°С на 30 мин. Сразу после охлаждения в холодильнике в обе пробирки приливают по 0.1 мл 0,2%-ного азотисто- кислого натрия (раствор должен быть све- жеприготовленным. т.е. готовят в период, когда пробы находятся в холодильнике). Пробы перемешивают встряхиванием и точно через 4 мин приливают по 0,1 мл 1,0%- ногораствора аммония сульфаминовокислого, встряхивают. Через 2 мин приливают 0.2 мл 0,01 %-ного раствора Ы-{1)-нафтилэтилендиаминдмгидрохло- рида. Пробы помещают в темноту на 1 ч и через каждые 15 мин встряхивают для удаления пузырьков газа. Наблюдают розовое окрашивание раствора, оптическую плотность которого определяют на микрофото- колориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно холостого опыта, который ставят параллельно гидролизованной и негидролиэован- ной пробам, но в котором экстрагировали измельченный квадрат чистой фильтровэль- ной бумаги размером 25x25 см. Количество сульфадимезина определяют по калибровочной кривой (мкмоль).

В гидролизованной пробе определяют количество общего сульфадимезина (ацети- лированный сульфадимезин плюс свободный сульфадимезин). В негидролизованной пробе определяют только свободный неэце- тилированный сульфадимезин. Количество ацетилированного находят по разнице между общим сульфадимезином и свободным. Активность ацетилирования выражают процентным отношением ацетилированного сульфадимезина к общему его количеству.

Если определенный процент эцетили- рования ниже 50%, то обследуемый кролик с медленным типом ацетилирования, если выше 50% то с быстрым типом ацетилирования. Таким образом отбирают группу животных, включающую медленных и быстрых

ацетиляторов для определения биологической активности исследуемого препарата.

Сульфадимезин, применяемый для фе- нотипирования, у отобранной группы кроликов с медленным и быстрым типом ацетилирования удаляется из организма в течение 1-2 сут и по истечении этого срока кроликов пользуют для определения биологической активности исследуемого препарата.

Испытуемый сульфаниламидный препарат в дозе, эквимолярной сульфадимезину, т.е. 0,072 ммоль на 1 кг, вводят внутрибрю- шинно и через 1 ч берут кровь из ушной краевой вены в сухую центрифужную пробирку. Кровь центрифугируют при 3000 об./мин 100 мин. В сыворотке определяют концентрацию свободной активной формы испытуемого препарата. В центрифужную пробирку, содержащую 0,5 мл 20%-ного ТХУ, добавляют 0,1 мл сыворотки и 1,4 мл дистиллированной воды до объема 2,0 мл. Через 5 мин пробу центрифугируют 30 мин при 3000 об./мин. Полученный центрифугат используют для определения концентраций активной свободной формы препарата. Для этого к 0,5 мл центрифугата приливают 0,1 мл 4 H.HCI. После охлаждения в холодильнике к пробе добавляют 0,1 мл 0,2%-ного NaNOa (свежеприготовленного), пробу встряхивают и через 4 мин добавляют 0,1 мл 1,0%-ного аммония сульфаминовокислого, снова перемешивают встряхиванием. Через 2 мин в пробы приливают 0,2 мл 0,01 %-ного М-(1)-нафтилэтилендиаминдигидрохлорида. Пробу помещают в темноту на 1 ч. в течение которого через каждые 15 мин ее встряхивают для удаления пузырьков газа. Оптическую плотность раствора измеряют при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см против холостого опыта, постановка которого аналогична и параллельна пробе, но вместо исследуемого материала, т.е. и вместо 0,1 мл сыворотки, добавляют 0.1 мл дистиллированной воды.

Концентрацию (в мкмоль/л) исследуемого сульфаниламидного препарата в его активной свободной форме находят по калибровочной кривой, построенной для данного препарата. Вычисляют среднюю величину концентрации свободной формы и ее среднюю ошибку, отдельно в обследуемой группе с медленным ацетиляторным фенотипом и отдельно -с быстрым ацетиляторным фенотипом. Вычисляют достоверность различия средних величин концентраций активной формы сульфанила- мида в сыворотке соответственно у медленных и быстрых ацетиляторов.

В случае если концентрация препарата превышает у медленных ацетиляторов соответствующий показатель у быстрых ацетиляторов на 23% и более определяют биологическую активность исследуемого препарата.

Пример 1.20 взрослым беспородным кроликам вводили раствор сульфадимезине 0,50 г/100 мл внутрибрюшинно с учетом веса животных 0,072 ммоль на 1 кг. Через 1 ч порле введения сульфадимезина берут кровь из ушной краевой вены уха в количестве нескольких капель на фильтровальную бумагу в квадрат размером 25x25 мм в объеме 0,075 мл. После этого кровь на бумажках высушивают на воздухе при комнатной температуре.

Перед употреблением вырезают квадрат 25x25 мм, содержащий высушенную пробу и измельчают его ножницами, помещают в центрифужную пробирку. К пробе добавляют 0,5 мл 20%-ного раствора трих- лоруксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и добавляют 1,5 мл дистиллированной воды. Пробы стоят 15-20 мин. ее несколько раз перемешивают. Далее пробу центрифугируют 20-30 мин при 3000 об./мин. Центрифугат разливают по 0,5 мл в две пробирки размером внутреннего диаметра 10 мм и высотой 120 мм. К 0,5 мл центрифугата в каждую из двух пробирок прибавляют по 0.1 мл 4 н.НС, перемешивают встряхиванием. Одну из двух пробирок плотно закрывают фольгой и ставят гидро- лизоваться на 45 мин в кипящую водяную баню (100°С). В гидролизованной пробе определяют общий сульфадимезин, т.е. аце- тилированный и свободный вместе, а в пробе, которую не подвергают гидролизу - свободный сульфадимезин. Далее обе пробы гидролизованнуюи негидролизованную, ставят в холодильник при 4°С на 30 мин. Сразу после охлаждения в холодильнике в обе пробы приливают по 0,1 мл 0,2%-ного азотистокислого натрия NaN02 (раствор №N02 должен быть свежеприготовленным т.е. готовят в период, когда пробы находятся в холодильнике). Пробы перемешивают- встряхиванием и точно через 4 мин приливают по 0,1 мл 1,0%-ного раствора аммония сульфаминовокислого, встряхивают. Через 2 мин приливают 0,2 мл 0,01 %-ного раствора М-(1)-нафтилэтилендиаминдигидрохло- рида. Пробы помещают в темноту на 1 ч через каждые 25 мин встряхивают для удаления пузырьков газа.

Оптическую плотность исследуемого раствора определяют на приборе микрофо- токолориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно

холостого опыта, который ставят параллельно гидролизованной и негидролизован- ной пробам, но ь которон экстрагировали измельченный квадрат чистой фильтровальной бумаги размером 25x25 мм. Расчет количества сульфадимезина (мкмоль) в пробе ведут по калибровочной кривой. Определяют количество общего сульфадимезина в гидролизованной пробе и количество свобедного сульфадимезина в негидролизо- ванной пробе. По разнице между общим и свободным сульфадимезином находят аце- тилированный сульфадимезин. Активность ацетилирования вычисляют по процентномуотношению ацетилированного сульфадимезина к общему.

В результате проведенного исследования у каждого из 20 кроликов по полученномупроценту ацетилирования

устанавливаютэцетиляторный фенотип. Если определенный процент ацетилирования ниже 50%, то обследуемый кролике медленным типом ацетилирования, если выше 50%, то с быстрым -Атом ацетилировэния.

Из обследуемых 20 беспородных кроликов в результате фенотипирования было выявлено 15 кроликов с быстрым типом ацетилирования, у которых средний процент ацетилирования составлял 71,7 ±1,2 и

5 - с медленным типом ацетилирования, где процент ацетилирования в среднем равнялся 32,9 ±4.7.

Из тестируемой группы далее отбирают 5 кроликов с медленным и 5 кроликов с

быстрым типом ацетилирсвзния и через 1-2 дн вводят внутрибрюшинно (натощак) испытуемый препарат норсульфазол в той же эк- вимолярной дозе - 0,072 ммоль на 1 кг массы тела. Через 1 ч оерут кроеь 0,5-1 мл

из краевой ушной вены в центрифужную пробирку. После центрифугирования в сыворотке определяют тслько концентрации активного неиэмэчнсгс лреларзта Для этого к 0,1 мл сыворотки добаеляют 0,5 мл 20%ного раствора трихлсруксусной кислоты для осаждения белков и 1,4 мл дистиллированной воды. Общий объем 2,0 мл, Тщательно перемешивают содерхммое пробирки и проба стоит 15-20 мин. Далее пробу центрифугируют при 3000 об./мин. Отбирают 0,5 мл центрифугзта в пробирку с размером внутреннего диаметра 10 мм и высотой 120 мм. Прибавляют к центрифугату 0,1 мл 4 H.HCI, перемешивают встряхиванием. Помещают пробу в холодильник 4°С на 30 мин. Сразу после охлаждения приливают 0.1 мл 0,2%-ного азотистокислого натрия NaN02 (свежеприготовленного). После каждого добавления реактивов содержимое пробирок

тщательно перемешивают встряхиванием. Через 4 мин 0.1 мл 1,0%-ного раствора аммония сульфаминовокислого, через 2 мин - 0,2 мл 0,01 %-ного раствора М-{1)-нзфтилэти- лендиаминдигидрохлорида. Пробу помещают в темноту на 1 ч и через каждые 15 мин встряхивают для удаления пузырьков газа. Оптическую плотность измеряют на приборе микрофотоколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно холостого опыта, который ставят параллельно с пробой, добавляя вместо сыворотки 0,1 мл дистиллированной воды. Расчет концентрации активной свободной формы норсульфазола ведут по калибровочной кривой, построенной для данного препарата.

В результате были получены следующие значения концентраций для свободной формы норсульфазола у 5 медленных кроликов, мкмоль/л: 253.234,300,157,253. что в среднем составляет 239+28. а у животных с быстрым типом ацетилирования: 110. 120, 68, 131,151, в среднем 117+Д7. Далее оценивают различия по критерию Стьюдента. При данном количестве случаев р 0,01 (т.,е. меньше 0,05).

Таким образом, при одинаковой дозировке норсульфазола концентрация его активной свободной формы будет выше у медленных ацетиляторов, в данном случае 239 мкмоль/л, чем у быстрых ацетиляторов 117 мкмоль/л на 104%, т.е. определена биологическая активность препарата.

Для подтверждения повышения точности предлагаемого способа по сравнению с известным была определена концентрация активной формы препарата норсульфазола у этих же 20 беспородных кроликов без предварительного фенотипгрсвзкия. Б среднем концентрация норсульфазола составляла 142±16 мкмоль/л.

Таким образом, среднее значение концентрации свободной активной формы препарата по известному способу 142i16 мкмоль/л на самом деле складывается из значительно более высокой концентрации испытуемого препарата у медленных зцети- ляторов 299+28 мкмоль/л, т.е. точность при сравнении с известным способом ДЛР медленных ацетиляторов повысилась на 68% и более низкой концентрация у быстрых ацетиляторов 117±17 мкмоль/л.

Пример 2.20 взрослым беспородным кроликам вводили раствор сульфадимезина 0,50 г/100 мл внутрибрюшинно с учетом веса животных 0,072 ммоль на 1 кг. Через 1ч после введения сульфадимезина берут кровь из ушной краевой вены уха в количестве нескольких капель (0.15 мл) на фильтровальную бумагу в квадрат размером 25x25 мм. После этого кровь на бумажках высушивают на воздухе при комнатной темлературе.

Перед употреблением вырезают квадрат 25x25 мм, содержащий высушенную пробу и измельчают его ножницами, помещают в центрифужную пробирку. К пробе

добавляют 0,5 мл 20%-ного раствора трих- лоруксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и добавляют 1,5 мл дистиллированной воды. Проба стоит 15-20 мин. ее несколько раз перемешивают. Далее пробу центрифугируют 20-30 мин при 3000 об./мин. Центрифугат разливают по 0,5 мл в две пробирки размером внутреннего диаметра 10 мм и высотой 120 мм. К 0.5 мл центрифугата в каждую из двух пробирок

прибавляют по 0,1 мл 4 н.НС, перемешивают встряхиванием. Одну из двух пробирок плотно закрывают фольгой и ставят гидро- лизоваться на 45 мин в кипящую водяную баню(100°С). В гидролизованной пробе опре дел я ют общий сульфадимезин, т.е. ацети- лированный и свободный вместе, а в пробе, которую не подвергают гидролизу -свободный сульфадимезин.

Далее обе пробы, гидролизовэнную и

негидролизованную, ставят в холодильник при 40°С на 30 мин. Сразу после охлаждения в холодильнике в обе пробы приливают по 0,1 мл 0,2 %-ного азотистокислого натрия NaN02 (раствор NaNCte должен быть свежеприготовленным, т.е. готовят в период, когда пробы находятся в холодильнике). Пробы перемешивают встряхиванием и точно через 4 мин приливают по 0,1 мл 1,0%-ного раствора аммония сульфаминовокислого.

встряхивают. Через 2 мин приливают 0.2 мл 0,01 %-ного раствора М-{1)-нафти/ этиленди- аминдигидрохлорида. Пробы помещают в темноту на 1 ч иерез каждые 25 мин встряхивают для удаления пузырьков газа. Оптическую плотность исследуемого раствора определяют на приборе микрофотоколориметре МКМФ-1 при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно холостого опыта, который ставят параллельно гидрсыизсванной и негидролиэован- ной пробам, но в котором экстрагировали измельченный квадрат чистой фильтровальной бумаги размером 25x25 мм. Расчет количества сульфадимезина (мкмоль) в пробе

ведут по калибровочной кривой. Определяют количество общего сульфадимезина в гидролизованной пробе и количество свободного сульфадимезина - в негидролизо- вянной пробе. По разнице между общим и

свободным сульфадимезином находят аце- тилированный сульфадимезин.

Активность ацетилирования вычисляют по процентному отношению ацетилирован- ного сульфадимезина к общему.

В результате проведенного исследования у каждого из 20 кроликов по полученному проценту ацетилирования устанавливают ацетиляторный фенотип. Если определенный процент ацетилирования ниже 50 %. то обследуемый кролик с медлен- ным типом ацетилирования, если выше 50%, то с быстрым типом ацетилирования.

Из обследуемых 20 беспородных кроликов в результате фенотипирования было вы- явлеио 10 кроликов с быстрым типом ацетилирования, у которых средний процент ацетилирования составлял 71,,2 и 10 - с медленным типом ацетилирования, где процент ацетилирования в среднем равнялся 32,,7. Из тестируемой группы далее отбирают 5 кроликов с медленным и 5 кроликов с быстрым типом ацетилирования и через 1-2 дн вводят внутрибрюшинно (натощак) испытуемый препарат белый стрептоцид в той же эквимолярной дозе 0,072 ммоль на 1 кг массы тела. Через 1 ч берут кровь 0,15 мл из краевой ушной вены в цен- трифужную пробирку. После центрифугирования в сыворотке определяют только концентрацию активного неизменного препарата. Для этого к 0,1 мл сыворотки добавляют 0,5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения белков и 1,4 мл дистиллированной воды. Общий объем 2,0 мл. Тщательно перемешивают содержимое пробирки и проба стоит 15-20 мин.

Далее пробу центрифугируют при 3000 об./мин. Отбирают 0,5 мл центрифугата в пробирку с размером внутреннего диаметра 10 мм и высотой 120 мм. Прибавляют к цен- трифугату 0,1 мл 4 н.НС, перемешивают встряхиванием. Помещают пробу в холодильник при 4°С на 30 мин. Сразу после охлаждения приливают 0,1 мл 0,2%-ного азотистокислого натрия NaNO (свежеприготовленного). После каждого добавления реактивов содержимое пробирок тщательно перемешивают встряхиванием. Через 4. мин 0,1 мл 1,0%-ного раствора аммония сульфаминовокислого, через 2 мин - 0,2 мл

0,01 %-ного раствора (1}-нафтилэтиленди- аминдигидрохлорида. Пробу помещают в темноту на 1 ч и через каждые 15 мин встряхивают для удаления пузырьков газа. Оптическую плотность измеряют на приборе микрофотоколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно холостого опыта, который ставят параллельно с пробой, добавляя вместо сыворотки 0,1 мл дистиллированной воды.

В сыворотке крови, определяли концентрацию активного свободного белого стрептоцида в мкмоль/л, которая у медленных

кроликов была: 105. 103. 105, 217. 181 - в среднем . а у быстрых 158, 89, 173, 165. 110 - в среднем 139±16, т.е. не превышает 30%. Таким образом, концентрация свободного белого стрептоцида в крови при

одинаковой дозировке не различается у медленных и быстрых ацетиляторов.

Концентрация свободного активного белого стрептоцида у 20 беспородных кроликов составила по известному способу 14210 мкмоль/л.

Таким образом, белый стрептоцид инак- тивируется в организме мономорфной системой ацетилирования и можно не учитывать его тип ацетилирования, как при

применении этого препарата для изучения биологической активности, так и для лечения.

Применение предлагаемого способа позволяет повысить точность определения биологической активности сульфаниламидов на 30% по сравнению с известным. Формула изобретения Способ определения биологической активности сульфаниламидов путем введения

исследуемого препарата экспериментальному животному и определения концентрации свободных и эуетилированных форм препарата в крови, о т л ичающийс ятем, что, с целью повышения точности определения, осуществляют забор 0,075-0,15 мл крови, выявляют медленный и быстрый ацетиляторный фенотип и при превышении концентрации препарата у медленных ацетиляторов по сравнению с быстрыми на 23%

и более определяют биологическую активность сульфаниламида.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии. Цель - повышение точности определения. С этой целью после введения исследуемого препарата экспериментальному животному осуществляют забор 0,075-0.15 мл крови, выявляют медленный и быстрый ацетилярный прототип и при превышении концентрации препарата у медленных ацетиляторов по сравнению с быстрыми на 23% и более определяют биологическую активность фаниламида. Применение способа позволяет повысить точность определения биологической активности сульфатилэми- дов на 30% по сравнению с прототипом.