Способ препаративной экспрессии генов в бесклеточной системе сопряженной транскрипции/трансляции Советский патент 1992 года по МПК C07K1/02 C12P21/02 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к способам препаративной экспрессии генов In vitro с использованием бесклеточных систем сопряженной транскрипции/трансляции. Преимущественной областью использования является препаративный синтез биологически активных пептидов и белков для научных и прикладных целей.

Целью изобретения является повышение выхода продукта экспрессия гена в виде пептида или белка За счет увеличения срока

работы бесклеЧочной системы сопряженной транскрипции/трансляции.

В бесклеточной системе сопряженной транскрипции/трансляции с использованием генов в виде молекул ДНК осуществляют непрерывное удаление из реакционной смеси синтезированного продукта и низкомолекулярных продуктов функционирования систем транскрипции и трансляции в виде AMP, ADP. GDP. CDP. UDP. фосфатов и пирофосфатов, непрерывное восстановление концентрации расходуемых низкомолекулярных веществ как аппарата трансляции в виде аминокислот, АТР, СТР. так и аппарата транскрипции в виде АТР, GTP, СТР, UTP, регенерацию АТР, GTP, CTP, DTP из образующихся AMP, ADP, GDP, CDP, UDP с последующим возвратом регенерированных компонентов в систему сопряженной транскрипции/трансляции.

Из прокариотических клеток готовят экстракт, содержащий все компоненты аппарата транскрипции и аппарата трансляции, но свободный от эндогенных мРНК и ДНК. К экстракту добавляют низкомолекулярные компоненты транскрипции и трансляции (аминокислоты, АТР. GTP, UTP, CTP), а также ген в виде молекулы ДНК. Реакционную смесь вносят в резервуар, где и протекаетпроцесс сопряженной транскрипции/трансляции. Для предотвращения остановки процесса из резервуара через полупроницаемую мембрану непрерывно отводят поодукты транскрипции (фосфата, ADP, GDP, CDP, UDP) и трансляции (синтезированный полипептид, AMP, GDP, фосфаты и пирофосфаты). Одновременно в резервуар подают аминокислоты, АТР, GTP, CTP, UTP для восстановления их исходной концентрации. Синтезированный полипептид собирают на колонке со специфическим сорбентом, а продукты транскрипции и трансляции собирают в специальном резервуаре для их последующей регенерации. Способ обеспечивает препэративную экспрессию генов в виде молекул ДНК в течение десятков часов с выходом синтезированного продукта (пол- ипептида) 50-200 мкг с 1 мл реакционной смеси.

Пример 1. Препаративная экспрессия генов плазмиды pUD 1B в бесклеточной системе.

Готооят стандартную бесклеточную систему сопряженной транскрипции/трансляции. Плазмида pUD18 содержит гены -лактамазы и дигидрофолзтредуктззы.

Раствор (А) содержит 55 мМ транс ацетат, рН 8,2, 11 мМ МдАс, 9,5 мМ CaCl2, 76 мМ КАс, 1,5 мМ ДТТ, 1,6% полиэтиленгли- коля 6000,5 мМ фосфоенолпирувата, 1,2 мМ АТР. по 0,8 мМ GTP, СТР и UTP. 5 мкг/мл фолиевой кислоты, 100 мкМ Н лейцина с удельной радиоактивностью 230 мКи/ммоль и 100 мкм каждой из остальных аминокислот. 1 мл реакционной смеси, приготовленной на буфере (А) содержит 430 мкл

экстракта S30, 150 мкг плазмиды pUD 18, 200 мкг суммарной тРНК.

Стандартная система сопряженной транскрипции/трансляции за 40 мин инкубации при 37°С (платовое значение) синтезирует по б пикомолей /3-лэктэмэзы и дигидрофолатредуктазы на 1 мл инкубационной смеси. В параллельном эксперименте в установке непрерывного действия к 1,0

мл реакционной смеси непрерывно подают раствор (А) со скоростью либо 3 мл/ч, либо 2 мл/ч, а продукты реакции отводят из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационную мембрану ХМ-100.

Кинетика экспрессии генов /3-лактамазы и дигидрофолатредуктазы в такой системе представлена на рис.1. За 50 ч функционирования такой системы в 1 мл реакционной смеси синтезируют по 4,1 наномолей /3-лактамазы и дигидрофолатредуктазы, что соответствует 212 мкг белков Д-лактэмазы и дигидрофолатредуктазы.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает препаративную экспрессию

генов в бесклеточной системе, синтезируя более чем в 500 раз больше продукта, чем это делает стандартная бесклеточная система сопряженной транскрипции/трансляции.

По предложенному техническому решению разработан лабораторный макет установки.

Формула изобретения Способ препаративной экспрессии генов в бесклеточной системе сопряженной транскрипции/трансляции с использованием генов ДНК с последующей очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что. с целью повышения выхода продукта

экспрессии гена в виде пептида или белка за счет увеличения срока действия системы, в процессе экспрессии из системы осуществляют непрерывное удаление целевого продукта и одновременно синтезируемых

соединений транскрипции и трансляции в виде AMP, ADP, GDP, CDP, UDP, фосфатов и пирофосфатов, непрерывное восстановление концентрации расходуемых низкомолекулярных соединений как системы трансляции в

виде аминокислот, АТР. GTP так и системы транскрипции в виде АТР. GTP, CTP, UTP. регенерацию АТР, GTP. CTP, UTP из образующихся AMP, ADP. GDP, CDP, UDP, с последующим возвратом регенерированных АТР,

GTP, CTP, UTP в систему сопряженной транскрипции/трансляции.

s

X

с. ф о

80

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано для препаративной экспрессии генов как в научных, так и в прикладных целях. Целью изобретения является повышение выхода продукта экспрессии гена в виде пептида или белка за счет увеличения срока работы бесклеточной системы сопряженной транскрипции/трансляции. Способ осуществляют в бесклеточной системе непрерывного действия, в которой используют внеклеточную систему сопряженной транскрипции/трансляции; генетический материал подают в систему в виде молекул ДНК; одновременно с непрерывным удалением продуктов трансляции из системы уда- ляют продукты транскрипции; в реакционной смеси непрерывно восстанавливают исходные концентрации низкомоле- кулярных веществ как аппарата трансляции, так и аппарата транскрипции. Возможна препэративная экспрессия практически любых генов в виде молекул ДНК. Способ может служить важным дополнением, а в некоторых случаях и альтернативой генноинженерным методам. Способ не требует специальной наработки матричных РНК. что значительно упрощает и удешевляет его в сравнении с известным способом препаративного синтеза пептидов и белков в бес клеточных системах трансляции непрерывного действия. 1 ил. Ё

г х « я о а s п «I н

X

О

40

п и 111II11111 ч ч i 1015

Время

I I | I I I I I I I М

2025