, . t i
Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а имен- но к использованию бесклеточных сис- |тем трансляции для синтеза биологи- чески активных полипепт1одов in vitro. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта за счет увеличения срока работы систе.мы трансляции,
В настоящее время разработан целый ряд бесклеточных систем трансляции на основе клеточ(гых экстршстов из различных прокариотическик и эукар ио- Т1«еских организмов. Все эти системы характеризуются, низкой эффективностью процесса и обьшно обеспечивают синтез лишь нескольктос .молекул полипептида на рибосому. Основные причины столь низкой э4х|1ективности бескле точных систем трансляции состоят в следующем:
1)бесклеточные системы трансляции содержат ограниченное количество субстратов реакции, в первую очередь источников энергии (АТР .и GTP), Попы шение содержания этих тсомпонеитов в системах имеет определелтггые пределы,
при превышении которых пабл одается ингибирование системьг трансляции
2)продукты распада субстратов реакции, В первую очередь ADP, AMP, GDP, фосфатЬ и пирофосфаты, ингибиторами системы трансляции,
На происходит адсорбция Поли пептида на иммунном сорбенте, специфичном к целевому полипептиду. Для более экономичной работы системы в блоке 4 происходит превращение образовавшихся AMP и GDP в АТР и GTP. Ву 4)ерньм раствор из блока 3- после адсорбции 1олипептида также проходит через систему регенерации АТР и GTP и через полупроницаемую мембрану . вновь поступает в реакцион1гую смесь, I П р и м е р 1 , Синтез белка оболочки вируса мозаики костра (BMV) на матрице BMV РНК. 4 в эукариотической системе трансляции из зародьшшй пше- йигда в стандартной системе и в установке непрерывного действия.
Раствор (А) состоял из 20 мМ HE- FES, 2,1 мМ r-fg(oAc).j, 115 мМ КоАс, 1 мМ АТР, 25 мкМ GTP, 250 мкМ спермидина- 25 мкМ Г Н лейцина с удельной радиоактивностью 24 Ки/ммол и 25 мкМ каждой из осталььшх 9 .at-m- Г1окислот. 3 мл Инкубационной смеси, приготовлепной на растворе (А), содержали 80 пикомолей 80S рибосом, 20 пикомолей BMV РНК 4, 3,7 оп.ед, белковой фракции SlOO, 150. ед, активности ингибитора рибоиуклеаз из плацент человека. О, 1 мкг лейпелти- на, 0,1 мкг апротенина, 0,1 пеп- статипа. О, химостатииа. Кинетика синтеза белка оболочки в стан
Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к использованию бесклеточньгх систем трансляции для синтеза биологически активных полипептидов и белков in vitro. Целью изобретения является повышение выхода целевого про.дукта за счет увеличения срока работы системы трансляции. Способы получения полипептидов в бесклеточных системах трансляции обладают рядом пре- им:,1деств как по сравнению с химическими методами (отсутствие необходимо- . сти защиты активных групп, высокая оптическая чистота продукта, относительно низкая cToTtMOCTb и др.), так и по сравнению с вариантами, в которых используются генно-инженерные ме- годы (предотвращение возможности деградации целевого продукта, отсутствие ограничений в отношении природы синтезируемого полипептида и др.). Основным недостатком всех известных способов синтеза палипептидов с использованием клеточного аппарата трансляции является их низкая эффективность. Предложенная совокупность методических приемов (нейрерное удаление из сферы реакции синтезированного продукта-, непрерывное восстановление расходуемьгх в реакции низкомолекулярных веществ и введение системы регенерации АТР и GTP) обеспечивает функционирование аппарата трансляции в длительном режиме и общее повьппе- ние зффективности процесса в несколько десятков раз. Благодаря этому новый способ синтеза полипептидов в бесклеточной системе может применяться для препаративных целей. Особо важным представляется использование изобретения для получения полипептидов длиной 15-50 аминокислотных остатков, т.к. производство их химическим путем является дорогостоящим, а синтез при помоп(и методов генной инженерии - во многих случаях малодоступным. 2 ил. § (Л ( 00 
3) сами продукты син.теза (полипеп-з; дгфтной системе при 25 С представлена
тиды) также могут быть ингиТ)Иторами отдельных стадий бесклетог ной системы трансляции,
В настоящем изобретеь ии указан)ые причины устраняются за счет непрерь В 40 ного отвода из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывного Восстановления исходной концентрации
низкомолекулярных веществ, расходующихся в процессе трансляции, 45
Основная реакция (синтез) полил:еп- тида протекает в блоке 1 (фиг,1), В pe3yjnbTaTe ее расходуются свободные аминокислоты, АТР и GTP и образуются
на .2 (кривая 1)
В параллельном эксперименте в установке непрерывного действия к 3 мл той же К1 псуба11;ионной смеси непрерывно подавался раствор (А) со скоростью 0,6 мл/ч, а продукчъГ реакции отводи- . лись из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационнуто мембрану Х1 1-50. В резз льтате в каме- РУ , содвржап1ую бесклеточную систему трансляц т. непрерывно подавались субстраты реакции (АТР, GTP, аминокислоты) и отводипись из нее продук- 1Ъ1. реакции (AltP, GDP, PJ, синтезирополипептид, AMP, GDP и неорганический5(| белок, оболочки). син.теза белка обо.почки в такой системе при 25°С в течение 15 ч представлена fta фиг. 2 (кривая 2),
фосфат. Для IpeдoтвpaщeF ия остановки процесса из блока 1 происходит одновременно отбор GDP, AMP и PL и подача GTP, АТР и аминокислот из блока 2, Отбор синтезируемого полипептйда про 55 исходит (в блоке 3) через мембрану в резервуар, из которого буферны раствор с полипепттщом поступает в колонку с аффинным иммуносорбентом.
дгфтной системе при 25 С представлена
на .2 (кривая 1)
В параллельном эксперименте в установке непрерывного действия к 3 мл той же К1 псуба11;ионной смеси непрерывно подавался раствор (А) со скоростью 0,6 мл/ч, а продукчъГ реакции отводи- лись из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационнуто мембрану Х1 1-50. В резз льтате в каме- РУ , содвржап1ую бесклеточную систему трансляц т. непрерывно подавались субстраты реакции (АТР, GTP, аминокислоты) и отводипись из нее продук- 1Ъ1. реакции (AltP, GDP, PJ, синтезирован ГоМ белок, оболочки). синван ГоМ белок, оболочки). син.теза белка обо.почки в такой системе при 25°С в течение 15 ч представлена fta фиг. 2 (кривая 2),
Из сравнения кинетических кривых 1 и 2 на фиг.2 можно сделать,следующие выводы;
Стандартная бесклеточная система трансляции выходит, на плато по ринте- зу белка через ч, Количест1 о син-
тезированного белка при этом составляет 0., 76 пикомолей белка оболочки на 1 пикомоль рибосом.
В Установке непрерывного действия синтез белка оболочли идет линейно в течение исследованного интервала времени (15ч) и количество синтезированного белка за 15ч составило 40 пикомолей на 1 пикомоль рибосом, ю . В целом для предложенной модели установки непрерывного действия эффективность синтеза белка за 15 ч возросла более чем в 50 раз.
П р и м е р 2. Синтез белка обо- is лочки фага MS 2 на матрице MS 2 РНК в прокариотической системе трансляции Е. coll в стандартной системе и в установке непрерывного действия.
Раствор (А) содержал 20 мМ Tris- 20 HCl, рН l,l, 10 мМ MgCli, 100 мМ , 1 мМ APT, 0,2 мМ GTP, 5 мМ креатин фосфата, 10 мкг/мл кр. фосфат киназы, 25 мМ J лейцина с удельной радиоактивностью 348 мки/ммоль и 25 25 MicM каждой из остальных аминокисот, 3 мл Инкубационной смеси, приготовленной на буфере (А), содержали 1 наномоль рибосом 70S, 1 наномоль S2 РНК, 3,5 ед. A-jjp белковой ЗО фракции S100.
В параллельном эксперименте в установке непрерывного действия к 3 мл той же инкубационной смеси непрерывно подавался раствор (А) со скоростью g 0,5 мл/ч, а продукты реакции отводились из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтраЦионную ембрану РМ-30. В результате в камеру, содержащую бесклеточную систему тран- Q сляции, непрерывно подавались субстраты реакции (АТР, GTP, аминокислоты) и отводились продукты реакции (AMP, GDP, Pj , синтезированный белок).45
Стандартная бесклеточная система трансляции выходит на плато. По синтезу белка через 2 ч. Количество синтезированного белка при этом составляет 1,1 пикомоля белка на 1 пикомоль ри- босом.
Сравнивают кинетику сиптоза белк;) оболочки п такой системе ттри 37 (; н течение 13 ч с кинетикой синтеза в стандартной бесклеточной системе,
В установке непрерывного дейстяия в течение 15 ч синтезировано 11 пикомолей белка на 1 пикомоль рибосом,
Таким образом-, предложенный спосо синтеза полипептидов в бесклеточной системе трансляции обеспечивает многократное Повьпцение скорости реакции и функционирование системы в длительном режиме. В результате этого выход целевого продукта повышается в несколько десятков раз (по сравнению с npoToTimoM) , I
Достигаемая эффективность процесса позволяет использовать способ для препаративного синтеза активных полипептидов и белков. Особо важное хозяйственное значение может иметь Получение этим способом полипептидов длиной 15-50 аминокислотных остатков, поскольку производство их химическим путем является крайне дорогостоящим, а для методов генной инженерии - во многих случаях малодоступным.
Формула изобретения
Способ получения пептидов и белков в бесклеточной системе трансляции с использованием матри шых РНК с последующим выделением и очисткой конечного продукта, отл.ичающий- с я тем, что, с целью повьпиения выхода целевого продукта за счет уве- ,личения срока работы системы трансляции, осуществляют непрерывное удаление из реакционной смеси синтезированного продукта, непрерывное восстановление концентрации расходуемых низкомолекулярных веществ аминокислот, АТР, GTP, регенерацию АТР и GTP из образующихся AMP н GDP с последующим возврап;ением регенерированных АТР и GTP в систему трансляции.
vf utfff/tue of. /frx 9ГР
Omfof /f/I/A QSP,f
Зародышей пшеницы
40 30, dfifpam t/rfcrfHfUffuHyrt
Cfffe
ffmfof eiMmt upjitHee fffftmued
«/
PHIC4 Si/pyca мозаики костра
| Roberts В.Е | |||
| and Paterson В.М |
