Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии,а именно к использованию бесклеточных систем трансляции для синтеза биологически активных полипептидов in vitro.
Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта за счет увеличения срока работы системы трансляции .
На фиг.1 и 2 приведены схемы, по- ясняюпще способ.
Разработан целый ряд бесклеточных систем трансляции на основе клеточных экстрактов из различных прокари- отическйх и эукариотических организмов. Все эти системы характеризуются низкой эффективностью процесса и обычно обеспечивают синтез лишь нескольких молекул полипептида на рибосому. Основные причины столь низкой эффективности бесклеточных систем трансляции
состоят в том, что бесклеточные системы трансляции содержат ограниченное количество субстратов реакции, в первую очередь источников энергии (АТР и ОТР). Повышение содержания этих компонентов в системах имеет определенные пределы, при превышении которых наблюдается ингибирование системы трансляции. Продукты распада субстратов реакции, в первую очередь
ADP, AMP, CDP, фосфаты и пирофосфаты, являются ингибиторами системы трансляции. Сами продукты синтеза (поли- пептиды) также могут быть .ингибиторами отдельных стадий бесклеточной системы трансляции.
Описанные причины устраняются за счет непрерывного отвода из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывного восстановления исходной конЈЈШы&
центрации низкомолекулярных веществ, расходующихся в процессе трансляции.
Основная реакция (синтез) полипеп тида протекает в блоке 1 (фиг.1). В результате ее расходуются свободные аминокислоты, АТР и GTP и образуют полипептид, AMP, GDP и неорганический фосфат. Дпя предотвращения остановки процесса из блока 1 происходит одно- временно отбор GDP, AMP и Р и подач iGTP, АТР и аминокислот из блока 2. Отбор синтезируемого полипептида происходит (в блоке 3) через мембрану в резервуар, из которого буферный ;раствор с полипептидом поступает в колонку с аффинным иммуносорбентом. На колонке происходит адсорбция полипептида на иммунном сорбенте, специфичном к целевому полипептиду. Ддя более экономичной работы системы в блоке 4 происходит превращение образовавшихся AMP и GDP в АТР и GTP. Буферный раствор из блока 3 после ад- сорбции полипептида также проходит через систему регенерации АТР и GTP и через полупроницаемую мембрану вновь поступает в реакционную смесь.
Пример 1. Синтез белка оболочки вируса мозаики костра (BMV) на матрице BMV РНК 4 в эукариотической системе трансляции из зародышей пшеницы в стандартной системе и в установке непрерывного действия.
Раствор (А) состоит из 20 мМ НЕ
PES, рН 7,6, 2,1 мМ Mg(oAc)2, 115 мМ КоАс, 1 мМ АТР, 25 мкМ GTP, 250 мкМ спермидина, 25 мкМ Ј IIJ лейцина с удельной радиоактивностью 24 Ки/ммоль и 25 мкМ каждой из остальных 19 аминокислот. 3 мл инкубационной смеси, приготовленной на растворе (А), содержит 80 пмоль 08 S рибосом, 20 пмоль BMV РНК 4, 3,7 оп.ёд. A2gg белковой фракции S100, 150 ед. активности ингибитора рибонуклеаз из плаценты человека, 0,1 мкг лейпептина, 0,1 мкг ап- ротенина, 0,1 мкг пепстатина,0,1 мкг химостатина. t
Кинетика синтеза белка оболочки в стандартной системе при 25 С представлена на фиг.2 (кривая 1).
В параллельном эксперименте в установке непрерывного действия к 3 мл той же инкубационной смеси непрерывно подается раствор (А) со скоростью 0,6 мл/ч, а продукты реакции отводятся из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационную
0 5
0
5
0
5
0
5
мембрану ХМ-50. В результате в камеру, содержащую бесклеточную систему трансляции, непрерывно подаются субстраты реакции (АТР, GTP, аминокислоты) и отводятся из нее продукты реакции (AMP, GDP, Р ., синтезированный белок оболочки) .
Кинетика синтеза -белка оболочки в такой системе при 25°С в течение 15ч представлена на фиг.2 (кривая 2).
Из сравнения кинетических кривых 1 и 2 (фиг.2) можно сделать следующие выводы.
Стандартная бесклеточная система трансляции выходит на плато по синтезу белка через 1,5 ч.Количество синтезированного белка при этом составляет 0,76 пмоль белка оболочки на 1 пмоль рибосом.
В установке непрерывного действия синтез белка оболочки идет линейно в течение исследованного интервала времени (15 ч), количество синтезированного белка за 15 ч 40 пмоль на 1 пмоль рибосом.
В целом для предложенной модели установки непрерывного действия эффективность синтеза белка за 15ч возрастает более чем в 50 раз.
Пример 2. Синтез белка оболочки фага MS 2 на матрице 2 MS 2 РНК в прокариотической системе трансляции Е. col i в стандартной системе и в установке непрерывного действия.
Раствор (А) содержит 20 мМ трис- - НС.1, рН 7,4, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NH4G1, 1 мМ APT, 0,2 мМ GTP, 5 мМ креатин фосфата, 10 мкг/мл кр. фос- фаткиназы, 25 мМ Ј с лейцина с удельной радиоактивностью 348 мКи/ /ммоль и 25 мкМ каждой из остальных аминокислот. 3 мл инкубационной смеси, приготовленной на буфере (А), содержат 1 нмоль рибосом 70S, 1 нмоль MS2 РНК, 3,5 ед. &.г80 белковой фракции S100.
.
В параллельном эксперименте в установку непрерывного действия к 3 мл той же инкубационной смеси непрерывно подают раствор (А) со скоростью 0,5 мл/ч, а продукты реакции отводятся из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационную мембрану РМ-ЗО.В результате в камеру, содержащую бесклеточную систему трансляции, непрерывно подают субстраты реакции (АТР, GTP,aMHHOKHcnoты) и отводят продукты реакции (ЛИГ. GDP, Р-, синтезированный белок).
Стандартная бесклеточная система трансляции выходит на плато по синтезу белка через 2 ч. Количество синтезированного белка при этом составляет i,1 лмоль белка на 1 пмоль рибосом.
Сравнивают кинетику синтеза белка оболочки в такой системе при 37°С в течение 15 ч с кинетикой синтеза в стандартной бесклеточной системе.
В установке непрерывного действия в течение 15ч синтезировано 11 пмоль белка на 1 пмоль рибосом.
Таким образом, предлагаемый способ синтеза полипептидов в бесклеточной системе трансляции обеспечивает многократное повышение скорости реакции и функционирование системы в длительном режиме. В результате этого выход целевого продукта повышается в несколько десятков раз (по сравнению с прототипом).
.Достигаемая эффективность процесса позволяет использовать способ для препаративного синтеза активных полипептидов .и белков. Особо важное хозяйственное значение может получение этим способом полипептидов длиной 15-50 аминокислотных остатков, поскольку производство их химическим путем является крайне дорогостоящим, а для методов генной инженерии - во многих случаях малодоступным.
Q Формула изобретения
Способ получения пептидов и белков в бесклеточной системе трансляции с использованием матричных РНК с после- дукпцим выделением и очисткой конечного продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого, продукта за .счет увеличения срока работы системы трансляции,осуществляют непрерывное удаление из реакционной смеси синтезированного продукта, непрерывное восстановление концентрации расходуемых низкомолекулярных веществ аминокислот, АТР, GTP, 5 регенерацию АТР и GTP из образующихся AMP и ППР с последуюящм возвращением регенерированных АТР и GTP в систему тра нсляции.
5
0
Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к использованию бесклеточных систем трансляции для синтеза биологически активных полипептидов in vitro. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта за счет увеличения срока работы системы трансляции. Способ препаративного синтеза полипептидов и белков в бесклеточной системе трансляции непрерывного действия предполагает непрерывный отвод из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывное восстановление исходной концентрации низкомолекулярных веществ, расходующихся в процессе трансляции.
ffs uftff#ufjrv r. ОГРч
Omfaf Лир ,Г)
f ЙеяЙрат 8 ргалчУвчнум
ff/rrSep cvxmtbapytttcrt fwrnrvmi
Зародышей пшеницы
40
30
20
10
Фиг. 2
| Roberts В.Е | |||
| and Paterson B.M | |||
| PNAS | |||
| Приспособление для склейки фанер в стыках | 1924 |
|
SU1973A1 |
