Способ диагностики вирусных заболеваний пасленовых культур Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 G01N33/53 

Изобретение относится к иммунофер- ментным методам диагностики и может быть использовано в селекционной и семеноводческой работе при оценке зараженностирастительного материала фитопатогенными вирусами:

Целью изобретения является повышение специфичности способа.

На фиг. 1 и 2 представлено распределение величин оптических плотностей, полученных предложенным и известным способам здоровых и больных образцов растений.

Способ диагностики вирусных заболеваний пасленовых культур заключается в том, что специфические к тестируемому вирусу антитела сорбируют на твердой фазе (в лунках полистиролового планшета), их избыток отмывают буфером промывания (БП), имеющим следующий состав, мае. %: Трис (гидроксиметил)-ами- нометан0.007-0,011 Глицин 0,070-0.068 Хлористый

натрий1.753-3.800 Твин-20 0,050-0.100 Дистиллированная вода Остальное Проводят блокировку твердой фазы пробноконьюгатным буферным раствором (ПКБ) со следующим составом компонентов. мас.%:

О СЛ 00

fc

Трис (гидроксиметил)-аминометан0,550-0,605

Глицин0,375-0,409

Теин-200,050-0,100

Обезжиренное

молоко5.000-30,000

Мертиолат натрия0.001-0,006

Дистиллированная

водаОстальное

Наносят сок исследуемых растений, разведенный в пробноконьюгатном буферном растворе (ПКБ), и коньюгат (антитела, меченные пероксидазой), разведенный в ПКБ; инкубируют и отмывают несвязавшиеся компоненты БП; вносят раствор субстрата, содержащего о-фенилендиамин, концентрированную перекись водорода, инкубируют в темноте на протяжении 30 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации реакцию останавливают добавлением в раствор субстрата 1N соляной кислоты.

Затем измеряют величину оптической плотности реакционной смеси на микрофотометре при длине волны 490 нм.

При значении оптической плотности 0,2 и выше диагностируют наличие вируса в исследуемой пробе сока растений.

Способ позволяет повысить специфичность ИФА при сохранении его высокой чувствительности.

Исследованы одни и те же образцы сока клубней картофеля предложенным и известным способами ИФА.

На фиг. 1 и 2 графики полученных результатов,

Способ обладает большей специфичностью по сравнению с известным, так как уровень фоновых реакций на фиг. 1 не превышает 0,2 ОП. В то время как на фиг. 2 уровень фоновых реакций достигает 1,0 ОП. и выше, что говорит о неспецифичности известного способа.

П р и м е р 1. Берут два клубнеплода картофеля сорта Арика. один из которых заражен У-вирусом, а другой здоровый. Из каждого клубня выделяют сок в две пробирки и проводят анализ.

Для этого антитела, специфичные к У- вирусу, предварительно разведенные в натрий-карбонатном буфере. рН 9,6, раскапывают в лунки планшета (по 0,1 мл в лунку) и инкубируют в течение 2 ч при 37°С. По окончании сорбции AT на твердой фазе содержимое планшета вытряхивают, высушивая его на фильтровальной бумаге, и трижды отмывают буфером промывания (БП), содержащим следующий состав компонентов, мас.%:

Трис (гидроксиметил)-ами-

нометан0,007 Глицин 0.070 Хлористый натрий 1,753 Твин-20 0,050 Дистиллированная

водаОстальное С учетом последующего разведения тестируемых проб в лунки планшета раскапывают пробно-коньюгатный буфер (ПКБ) (по 0,090 мл в лунку), содержащий следующий состав компонентов, мас.%: Трис (гидроксиметил)-ами- нометан 0,550 Глицин 0,409 Мертиолат 0.001 Обезжиренное

молоко5,000 Твин-20 0,050 Дистиллированная вода Остальное

После блокировки в лунки планшета вносят тестируемые пробы 0,010 мл в лунку, пеоемешивают их с ПКБ и инкубируют в течение 16 ч при 6°С. По окончании проце- дуры содержимое планшета вытряхивают и отмывают три раза БП. высушивая его после каждой промывки на фильтровальной бумаге.

Коньюгат (антитела, меченные перокси- дазой) разводят в рабочем объеме ПКБ, рас- капывают в лунки планшета (по 0,090 мл в лунку) и инкубируют в течение 2 ч при 37°С. По окончании процедуры содержимое планшета вытряхивают и отмывают пять раз БП, высушивая его после каждой промывки на фильтровальной бумаге.

Готовят раствор субстрата в рабочем объеме 0,1 М фосфатно-цитратного буфера рН 5,0, в который вносят 4 мг о-фенилен- диамина и 0,005 мл концентрированной перекиси водорода. После растворения субстрат раскапывают в лунки планшета (по 0,090 мл в лунку) и инкубируют в темноте на протяжении 30 мин при комнатной темпера- туре. По окончании инкубации реакцию останавливают добавлением в раствор субстрата 1 N соляной кислоты (по 0.060 мл в лунку).

Измеряют величину оптической плотно- сти на микрофотометре при длине волны 490 нм.

Значения ОП. полученные в этом примере для здоровых и зараженных образцов, соответственно составили 0,009 ±0,003 и 0.168 ±0,037 ОП. Из сопоставления этих данных можно заключить, что предложенный способ обладает достаточно высокой специфичностью, так как положительные и отрицательные результаты достоверно отпинаются друг от друга В то время как при использовании известного способа величины оптических плотностей для здоровых и зараженных образцов соответственно составили 0,239 ± 0.074 и 0,408 ± 0,281 ОП.

Снижение содержания компонентов в буферных растворах ниже указанных границ приводит к ухудшению качества отмывки планшет и увеличивает вероятность возникновения ложноположительных и ложноотрицательных результатов в методе ИФА.

П р и м е р 2. Методика проведения ИФА та же, что и в примере 1, но используют другие соотношения компонентов в рекомендуемых буферных системах.

Так, разведение растительного сока и коньюгата проводят в ПКБ, имеющем следующий состав компонентов, мас.%: Трис (гидроксиметил)-ами- нометан0,605 Глицин 0,375 Метриолат 0,006 Обезжиренное

молоко30,000 Твин-20 0.100 Дистиллированная вода Остальное Отмывку планшета от несвязавшихся компонентов проводят БП, содержащим следующий состав, мас.%: Трис (гидроксиметил)-ами- нометан 0,011 Глицин 0,068 Хлористый натрий 3,800 Твин-20 0,100 Значения ОП, полученные в этом примере для здоровых и зараженных образцов, соответственно составляют 0,119 ± 0,018 и 0,305 ±0.034 ОП. Из полученных данных следует, что уровень фоновых реакций не превышает величины 0,20 ОП. (см. фиг. 1 и 2).

Дальнейшее увеличение содержания компонентов в этих буферных системах нецелесообразно, так как снижается специфичность способа, приводит к повышению расхода реактивов.

ПримерЗ. Методика проведения теста та же, что и в примере 1 (с учетом внесенных изменений), но используют другие соотношения компонентов.

Состав ПКБ, оптимизированный по средним значениям, мас.%: Трис (гидроксиметил)-ами- нометан0,555 Глицин 0,400 Мертиолат 0,002 Обезжиренное молоко 10,000

Твин-200,050

Дистиллированная

водаОстальное

Состав БП, оптимизированный по сред- ним значениям, мас.%:

Трис (гидроксиметил)-аминометан0,008

Глицин0,069

Хлористый натрий2,9225 Дистиллированная

водаОстальное

Интенсивность положительных реакций в этом случае составила 0,,027 ОП при средней величине фона 0,038 ± 0.002 ОП. Сопоставив средние величины ОП в ПК и ОК, видим, что они отличаются друг от друга в большей степени, чем в предыдущем примере. Однако эта разница оказалась меньшей, чем в примере 1. Пример4. Методика проведения теста та же, что и в примере 1, но в качестве ОК был протестирован образец здорового клубня (масса 3 гр) С. Гатчинский, а в качестве ПК-образец клубня того же сорта и массы, зараженного X вирусом картофеля (ХВК).

Средний уровень фона в примере 4 не превышал 0,020 ±0,006 ОП, а интенсивность положительных реакций достигала 0,611 ± 0,020 ОП.

В то время, как у прототипа эти величины соответственно составили 0,257 0,163 и 0,902 + 0,216 ОП. Очевидно, что способ превосходит прототип по специфичности тестирования здоровых образцов при со- хранении достаточно высокого уровня положительных реакций.

П ример5. Методика проведения теста та же, что и в примере 2. При этом тестировали те же образцы клубней картофеля, ко- торые были проведены в примере 4.

Средний уровень фоновых реакций в этом примере также повысился, как и в примере 2, и составил 0,104 ±О.ОЗООП. Интенсивность положительных реакций достигла величины 0,821 ± 0,094 ОП и оказалась выше, чем в предыдущем примере.

Приме р 6. Методика проведения теста та же, что и в примере 3. При этом тестировали те же образцы клубней картофеля, ко- торые были использованы в примере 4.

Интенсивность положительных реакций незначительно понизилась по сравнению с предыдущим примером и составила 0,739 i 0,081 ОП. В то время как уровень фоновых реакций не выходил за пределы средней величины 0.027±0,006 ОП.

П ример. Методика проведения теста та же, что и в примере 7, но в качестве ОК был протестирован образец здорового сполого плода томатов (масса 3 г) с, Ракета, а в качестве ПК образец плода томатов того же сорта и массы, зараженного вирусом табачной мозаики (ВТМ).

Поскольку интенсивность прохождения положительных реакций у способа и прототипа была оценена одинаково высоко для образца, зараженного ВТМ, т.е. выше 2,00 ОП (микрофотометр зашкаливал), остановимся только на анализе фоновых величин. В примере 7 уровень фона не превышал 0,018 ± 0,016 ОП. В то время, как у прототипа фоновые реакции оказались значительно выше и достигали величины 0,179± ± 0,038 ОП. Таким образом, предложенный способ превосходит известный по специфичности тестирования здоровых образцов и в то же время не уступает ему по чувствительности определения ВТМ, ХВК и УВК в зараженных плодах томата и клубнях карто- феля.

Формула изобретения Способ диагностики вирусных заболеваний пасленовых культур с помощью твер- дофазного иммуноферментного анализа, предусматривающий нанесение специфических антител на твердую фазу, отмывку несвязавшихся компонентов с твердой фазой буферным раствором, нанесение иссле- дуемого сока, инкубирование полученной

смеси, отмывку несвязавшихся компонентов, нанесение коньюгата, повторное инкубирование смеси, отмывку несвязавшихся компонентов с последующим нанесением субстрата, инкубированием смеси, измерением оптической плотности и оценкой результатов по величине оптической плотности, отличающийся тем. что, с целью повышения специфичности способа, перед нанесением исследуемого сока проводят обработку твердой фазы буферным раствором, содержащим, мас.%: Трис (гидроксиметил}-ами- нометан0,550-0,605 Глицин 0,375-0.409 Мертиолат 0.001-0.006 Обезжиренное

молоко5.000-30.000 Твин-20 0.050-0,100 Дистиллированная вода Остальное, а отмывку несвязавшихся компонентов на всех стадиях анализа осуществляют буферным раствором, содержащим, мэс,%: Трис (гидроксиметил)-аминометан

Глицин

Хлористый натрий

Твин-20

Дистиллированная

вода

0.007-0.011 0.068-0.070 1.753-3.800 0.050-0.100

Остальное

Изобретение относится к иммунофер- ментам методом диагностики и может быть использовано в селекционной и семеноводческой работе при оценке зараженности растительного материала фитопатогенными вирусами. Целью изобретения является повышение специфичности способа. Способ заключается в том, что специфичные к тестируемому вирусу антитела сорбируют на твердой фазе, их избыток отмывают буфером промывания (БП), содержащим (мас.%) трис (гидроксилметил)-аминометан 0.007- 0,011; глицин 0,070-0,068; хлористый натрий 1,753-3,800; твин-20- 0,050-0,100; дистиллированную воду, проводят блокировку твердой фазы пробно-коньюгатным буферным раствором, содержащим (мас.%) трис (гидроксиметил)-аминометан 0,550- 0,605; глицин 0,409-0,375, твин-20- 0.50- 0,100; обезжиренное молоко 5,000-30,000, мертиолат натрия 0,001-0,006; дистиллированную воду остальное, наносят последова- тельно сок исследуемых растений и коньюгат, разведенные в пробно-коньюгат- ном буферном растворе, инкубируют, отмывают несвязавшиеся компоненты БП. вносят раствор субстрата, инкубируют и измеряют величину оптической плотности при длине волны 490 нм и при значении плотности 0,2 и выше диагностируют наличие вируса в соке. 2 ил. fe

V.

30

20

10

/