Способ селективного определения биогенных порфиринов Советский патент 1993 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к способам определения порфиринов и может быть использовано в медицине, биотехнологии, биохимических исследованиях.

Целью изобретения является упрощение способа селективного определения порфиринов, ускорение и повышение чувствительности анализа при определении про- то-, копро- и уропорфиринов.

Поставленная цель достигается тем, что анализируемые растворы биологических жидкостей, содержащие данные порфирины или их смеси, обрабатывают солями двух валентного палладия таким образом, чтобы количественно перевести все содержащиеся в них порфирины и их палладиевые комплексы, после чего определяют содержание порфиринов по фосфоресценции их Pd-ком- плексы в водных растворах с использованием добавок различных поверхностно активных веществ (ПАВ),

Pd-порфирины обладают способностью интенсивно фосфоресцировать в водных растворах при комнатной температуре, причем квантовые выходы фосфоресценции Pd- порфиринов (порядка 0,1-0,2) выше, чем квантовые выходы флуоресценции соответствующих порфиринов (соответственно порядка 0,05-0,1). Более того, длительная люминесценция Pd-порфиринов (времена свечения порядка 1 мс) и спектральные свойства оптимально подходят для их селек00

о

GO

CD Си N

тивного определения в сложных биологических системах с рекордно высокой чувстви- тельностью методом импульсной флуориметрии с миллисекундным временным разрешением. Эти соединения, в частности, нашли применение для ковалентного маркирования антигенов и антител в фосфо- ресцентном иммуноанализе.

Добавки ПАВ влияют на фосфоресценцию Pd-порфиринов. Взаимодействие соединений порфириновой природы с различными типами ПАВ различается. Поэтому ПАВ влияют по-разному на фосфорес- цёнцию различных Pd-порфиринов. Используя эти различия, можно подобрать ПАВ таким образом, что, измерив интенсивности или времени жизни фосфоресценции растворов, содержащих смеси Pd-порфиринов, в присутствии добавок различных ПАВ и без ПАВ, можно рассчитать содержание отдельных компонентов (индивидуальные порфирины или группы порфиринов). Для определения, например, трех различных порфиринов (или групп порфиринов) достаточно провести измерения фосфоресценции в трех различных системах. В данном случае это были буфер без ПАВ, буфер с добавкой 0,5% Тритона Х-100 (неионоген- ный ПАВ) и буфер с добавкой 1 мМ цетилт- риметиламмоний -бромида (катионный ПАВ).

При этом, что метод не универсален и применим лишь к определенным образцам, содержащим не очень сложные смеси порфиринов (2-4 компонента). Однако он хорошо подходит для первичного анализа образцов мочи, крови, экстрактов тканей, кала. Он позволяет существенно ускорить процесс первичного скрининга большого числа образцов (более 100 анализов в час), сделать его технологичным и автоматизированным. Выявленные образцы с аномальным распределением порфиринов далее могут исследоваться более подробно другими методами, в частности, хроматографиче- скими (ВЭЖХ, ТСХ).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Получение палладиевых комплексов порфиринов. К 1 мл растворов копропорфирина I, копропорфирина III, уро- порфирина III или протопорфирина 1Х(концентрация 1-100 нМоль/л) в 0,05 М ацетатном буфере, рН 5,0, добавляли 0,01 мл раствора PdCla в 0,01 М HCI, и инкубировали на водяной бане при 80°С 5 мин. Затем растворы охлаждали и добавляли 0,1 мл водного раствора сульфита натрия (100 мг/мл), при этом рН системе устанавливался в районе 6,5-7,5. Записывали спектры люминесценции растворов на спектрофлуориметре LS -50 (Perkin Elmer) в диапазоне длин волн 550-750 нм при возбуждении на длине волны 395 нм. Исчезновение полос флуоресценции порфиринов (в области 620 нм) и появление полос фосфоресценции Pd-порфиринов (в области 670 нм) в спектрах люминесценции свидетельствует о том, что порфирины полностью переходили в форму

палладиевых комплексов.

Процесс имеет оптимум по концентрации соли палладия в области 20-500 мкМ Pd +. Эта концентрация является предпочтительной.

Скорость включения палладия в порфирины зависит от температуры инкубации.Снижение температуры требует увеличения времени инкубации. Например, для температуры 37°С для полного перехода порфиринов в палладиевые комплексы составляет более 2 часов. Предпочтитель- ныеусловия -2-15-минутная инкубация при 60-8°С,

В ацетатном буфере включения палладия в порфирины проходит лучше, чем в цитратном. Изменение рН буферного раствора в диапазоне 3-6 не имеет существенного влияния на процесс.

Измерение высокотемпературной фосфоресценции Pd-порфиринов в различных буферных системах, содержащих ПАВ. После превращения порфиринов в палладиевые комплексы и добавления сульфита натрия (см.пример 1) измеряли интенсивность фосфоресценции растворов без ПАВ и в присутствии добавок ПАВ. Спектры возбуждения и эмиссии, а также кинетики затухания фосфоресценции растворов Pd-производных различных порфиринов в

присутствии различных ПАВ и без ПАВ записывали на люминесцентном спектрометре LS-50 (Rerkln Elmer, Англия).

Измерение.интенсивности люминесценции проводили в режиме Фосфоресценция в условиях оптимума свечения Pd-порфиринов. Оптимальные условия измерения следующие: возбуждение при 395 нм, регистрация при667 нм время задержки после вспышки - 10-300 мкс; время счета 500-5000 мкс; время накопления сигнала - 1-10 сек.

Измерения проводили в трех буферных системах: 1) система без добавок ПАВ; 2) то же с добавкой 0,5% Тритона Х-100 (ТХ-100, неионогенный ПАВ); 3) то же с добавкой 1 мМ цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ, катионный ПАВ).

Анионные ПАВ (типа додецилсупьфата натрия) как правило слабо взаимодействуют

с поликарбоксильными биогенными порфи- ринами из-за электростатических затрудне- ний и поэтому слабо влияют на фосфоресцентные свойства.

Параметры фосфоресценции различных Pd-порфиринов в присутствии различных типов ПАВ, а также удельные интенсивности фосфоренсценции различных порфири- нов в различных ПАВ приведены в таблице.

Видно что, в отличие от свободных пор- фиринов, спектры возбуждения и эмиссии Pd-порфиринов практически идентичны. В то же время интенсивности и время фосфоресценции порфиринов в различных буферных системах значительно различаются (для одного и того же порфирина и между раз- лучными порфиринами или группами порфиринов. Такая особенность дает возможность, измеряя в одних и тех же условиях интенсивности и/или времена жиз- ни фосфоресценции растворов, содержащих смесь порфиринов, в присутствии добавок различных ПАВ, рассчитать концентрации и/или соотношение отдельных компонентов.

В описанных условиях чувствительность детекции Pd-порфиринов составляет порядка 0,1 пикомоль/л. Максимальная чувствительность достигается в растворе с 0,5% Тритона Х-100, поскольку в этом рас- творе порфир ины фосфоресцируют наибо1 лее интенсивно. Для способа-прототипа чувствительность составляет 10 пмоль/л.

П р и м е р 2. Селективное определение порфиринов в их смесях, В пробирки, содер- жащие 1 мл 0,05 М ацетатного буфера, рН 5,0, 0,1 мМ PdCla, добавляют по 0,05 мл исследуемых образцов, содержащих известные концентрации копропорфиринов и уропорфиринов, и обрабатывают, как опи- сано в примере 1. При этом порфирины переходят в форму Pd-комплексов,

Из каждой пробирки отбирают 2 пробы по 0,3 мл и переносят в полистирольные пробирки на 0,5 мл (Cllnicon), В первые про- бы добавляют 0,02 мл 10 мМ раствора ЦТАБ, а во вторые - по 0,02 мл 5% раствора Тритона Х-100. После этого измеряют интенсивности фосфоресценции всех проб в условиях, описанных в примере 2, и по ре- зультатам двух измерений рассчитывают концентрации порфиринов в образцах. Для этого решается система линейных уравне- ний с двумя неизвестными - определяемые концентрации копропорфиринов и уропор- фиринов:

- -

0)

УП

-

-

Коэффициентами уравнений служат удельные интенсивности фосфоресценции копропорфиринов (ai и 32) и уропорфиринов (bi и Ьа) в растворах ТХ-100 и ЦТАБ, соответственно (см.Таблицу 1), определенные ранее в примере 2. Результаты селективного определения порфиринов соответствуют заданным значениям.

Аналогичным образом могут быть определены порфирины в тройных смесях (коп- ро-, уро- и протопорфирин), проводя для этого измерения фосфоресценции в трех буферных системах: без добавок измерения фосфоресценции в трех буферных системах: без добавок ПАВ, с добавкой 0,5% ТХ-100 и с добавкой 1мМ ЦТАБ. Расчет концентраций компонентов осуществляют известным матричным методом решения систем линейных уравнений. Расчеты легко автоматизируются использованием ЭВМ.

Производительность способа - около 100 образцов в час.

П р и м е р 3. Определение порфиринов в мбче, Способ осуществляют аналогично примеру 2, используя в качестве образцов 0,05 мл мочи. По результатам измерения в трех буферных системах рассчитывают концентрации порфиринов в пробах.

П р и м е р 4. Способ проводят аналогично примеру 1, но вместо хлорида палладия используют.ацетат палладия в той же концентрации. Результаты не изменяются.

П р и м е р 5. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубируют 10 мин при 60°С, Результаты не изменяются.

П р и м е р 6. Способ про водят аналогично примеру 1, но инкубируют с солью палладия 2 часа при 37°С. Результаты не изменяются.

Пример. Способ проводят аналогичного примеру 1, но вместо сульфита натрия используют бисульфит натрия в той же концентрации 100 мг/мл, контролируя, чтобы после его добавления рН раствора был в районе 6,5-7,5. Результаты не изменяются.

Примерб. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо 1 мМ раствора ЦТАБ используют 1 мМ цетилпириди- ний бромид (катионный ПАВ), Результаты аналогичны.

П р и м е р 9. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо 0,5% раствора Тритона Х-100 используют 0,5% раствора Твина-20. Результаты аналогичны.

( П р и м е р 10. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо 1 мМ раствора ЦТАБ используют 0,1 мМ ЦТАБ. Результаты не изменяются.

Таким образом, способ позволяет быстро и с высокой производительностью проводить анализ на содержание порфиринов в биологических образцах (моча, экстракты крови, тканей, кала и т.п.) с целью выявления нарушений порфиринового обмена. Формула изобретения 1. Способ селективного определения биогенных порфиринов, включающий обработку образца химическим реактивом в растворе, возбуждение и регистрацию люминесценции порфиринов, по которой проводят определение их концентраций, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, упрощения и ускорения, анализа, образец обрабатывают в буфере с рН 3-6 .избытком растворимой соли палладия Pd (II) при 37-100°С до полного превращения, порфиринов в их палладиевые

комплексы, проводят измерение фосфоресценции полученного раствора в присутствии сульфита или бисульфита натрия в .конечной концентрации последнего 5-15

мг/мл при рН 6,5-7,5 при последовательном введении в раствор неионогенного поверхностно-активного вещества и кати- онного поверхностно-активного вещества и без введения в раствор поверхностно-активного вещества и по результатам измерений рассчитывают концентрации порфиринов матричным методом решения систем линейных уравнений.

2. Способ по п.1,отличающийся

тем, что обработку образца, содержащего смесь протопорфирина, копропорфиринов и уропорфиринов ведут в ацетатном буфере в присутствии 20-500 мкмоль Pd (II) в течение 2-15 мин при 60-80°С, а в качестве

поверхностно-активных веществ используют Тритон Х-100 в конечной концентрации 0,2-1 % и цетилтриметиламмоний бромид в конечной концентрации 0,1-10 ммоль.

Способ селективного определения биогенных порфиринов предусматривает обработку образца и последующее определение отдельных порфиринов или групп порфиринов по люминесценции с использованием стандартов. Образец обрабатывают раствором соли Pd (II) таким образом, чтобы полностью перевести находящиеся в нем порфирины в палладиевые комплексы. Определение ведут путем измерения фосфоресценции полученного после обработки раствора в присутствии сульфита или сульфита натрия в конечной концентрации 5-15 мг/Мл при рН 6,5-7,5 в присутствии добавок поверхностно-активных веществ (ПАВ) и без ПАВ, после чего по результатам нескольких измерений рассчитывают концентрации определяемых порфиринов. 1 з.п.ф-лы, 1 табл. ел с

Люминесцентные свойство некоторых Pd-порфиринов.