Способ регенерации растений из пыльников вишне-черешневых гибридов Советский патент 1992 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в се- лек1Ц{онно-генетических работах с плодовыми культурами для пoлз чeния гаплоидных растений.

Известна успешная попытка регенератщи древесных растений, в частности

тополя, из пьшьников. Однако на плодовых культуттах этот способ не дает положительного результата.

Известен способ регенерации растений из пьшьников черегант и земляники, включающий получение из пьшьников на среде Мурасиге н (куга с добавлением НУК - 2 мг/.ч, индолилук- 31 eyeнон кислоты (ИУК) 2 мг/л и кинети на 6 мг/л„ Однако образовавпшйея каллус характерияовалея еравнительно невыеокими темпами роста и отеутетви ем образования побегов. Органогенез из образовавгхихея тканей не набл1утал ни на одном из испытанных вариантах сред. П.елью изобретения является повы1ие ние выхода раетений-регенерантов за счет индукции морфогенеза каллуса. Пример, испытаний взят вишне-черешневый гибрид N 1/1 в трех вариантах опыта: с минимальной, сре,и; ней и максимальной кондентрадиями дополнительно вводимых коьшонентов (ем, табл.1). Пыльники высаживают на питательну среду Хеллнра, coдepжaFJyю, мг/л: макросоли КС1 75(1; NaNO, bOOJ MgSO 2H20 250; 25 CaCl2.) 75; микросоли ZnSO УКлО 1; g Г; MnS044H2() 0,1; (.j() 0,03; AlCl 0,03; 0,03, ICL 0,01 FeS047H2() 557; Na ЭДТА 745; витамины - В (тиамин) О, Г, К (пиридоксин) Hjl, рр (никотиновая кислота) n,5j мезо инозит П,5, глута миновая кислота 1,0,сахароза г/л агар-агар 7,П г/л. Дополнительно вводят фитогормоны указанные в табл.1. . . После получения каллусной ткани ее пассируют на агаризованную питательную среду Курасиге-Скуга, содержащую, мг/л: КК4№)з 1Ь50; KN05 1900; CaClg-2Н С) 440.; HgSO 370; Г/о; Na. ЗЛТА 37,«;, FeS04-7H2 27, .) 0,25; CuS()4-5K20 0,025; И,К()з bj,2, MnS() 22,3; ZnS04.. 8,6; Kl 0,83; 0,025; тиаин0.г4; мезоинозит 100,0, сахароза 30000; агар-агар 10000. Дополнительно вводят в среду фитогор моны в количестве, указанном в табл.1 Культивирование осуществляют при 14-16 часовом фотопериоде в течение 2-3 мес до образования хорошо развитой корневой системы, затем каллусну ткань с корневой системой разрезают на отдельные кусочки и померцают их на питательную среду Мурасиге-Скуга В питательную среду Мурасиге и Скуга вводят, мг/л: кинетин 1,0-2,О ЪБШ 3,0-5,0; аденйн 1,0-2,0, 14 2,0 ферулловая кислота 0,5-0,/, КУК 0,2-0,4; НУК 0,2-(1,4, КМК 0,2-0,4; 2,4 Л О,1-0,3 (см. табл.1). После образования побетов с листьями, чтобы устранить аномалии в росте корней и стеблей у растений-регене- рантов в питательную среду Мурасиге и Скуга вводят 1,0-3,0 мг/л ГК и ( 31 ,0 мг/л I-IMK. Культивирование каллусов и Bbipaufli- вание раетений-регенерантов на питательных средах производят на свету от люминесцентных ламп интенсивностью 3000-3500 при 14-16-часовом.фотопериоде и 25-27(;. Влияние различных добавок фитогор- МО нов на получение каллусной ткани корней и побегов, а также на устранение аномального развития растений регенерантов показано в табл. 2. На минимальной среде получено 498 посеянных пыльников,пьшьников с кал-лусом получено 206 шт. или 41,4%, на средней среде - 453 посеянных пыльников, пьшьников с каллусом 175 )чт. или 38,6%; на максимальной среде - 391 посеянный пыльник, пьшьников с каллусом 149 или 38,1%. На минимальной среде получено 50 каллусньгх тканей, каллусов с корнями 10 шт. или 20%, на средней среде - 38 каллусных тканей, каллусов с корнями Ю шт. или 26,3%, на максимальной среде - 34 каллуеньгх тканей, каллуеов с корнями 8 шт. или 23,5% На минимальной среде при 140 исходных ткан-ей получено 25 побегов с листьями или 17,9% на средней среде при 16( исходных: тканей - 30 побегов или 18,8%} на максимальной среде при 120 исходных тканей - 21 побег или 17,5%. I На минимальной среде при 25 нормально развитых иеходных раетениях получено 20 растений или, 80%, на сред,ней среде при 26 исходных растениях - 21 нормально развитое растение или 80,,8%j на максимал1 ной среде при 25 исходных растениях - 23 нормально развитых растения-или 92% Таким образом, использование предлагаемого способа обеспечивает 8092jO%-ный выход нормально развитых растений. Изобретение может найти широкое применение в селекционно-генетических работах с плодовыми культурами для получения гаплоидных растений. Способ прост, эффективен и не тр бует дополнительного оборудования и помещений. Способ позволяет создавать новые формы вишне-череганевых гибридов для работ по селекции вишни или непосред ственно для сельскохозяйственного производства, получать ценные геноти пы, ускорять селекционный в 23 раза по сравнению с обьгчнь -1И способами селекции. Формула изобретения Способ регенерации растений из пыльников вишне-черешневык гибридов, включаю1ций эксплантацию пыльников на питательную сре;т;у, получение каллусной ткани и последующее ее культи .вирование, отличаю лдийся тем, что, с целью ловьааения выхода растений-регенерантов за счет индукции морфогенеза каллуса, получение каллусной ткани осуществляют на пита тельной среде Хеллера, в которзпо дополнительно вводят 5(1(-800 мг/л гид- ролизата казеина, 1{)(1-2(0 мг/л дрожжевого экстракта, (1,8-t,О мг/л 2,4/5,

Концентра1щя компонентов добавки экзогенных регуляторов роста в питательных средах и количество получаемых растений ИМК в количестве 1,П--Т,15 мг/л, ИУК 1,0-3,0 мг/л, НУК 1,0-1,5 мг/л и 6БАП в количестве П,,0 мг/л, ледующее культивирование каплусной ткани до образования корней проводят на питательной среде Мурасиге-Скуга в присутствии 0,1-0,3 мг/л кинетика, 4,0-6,0 мг/л гибберелловой кислоты, 4,0 6,0 мг/л ферулловой кислоты, 0,5- 1,5 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,5-1,5 мг/л ИУК и 0,,5 мг/л НУК, после чего осуществляют разделение каллусной ткани с корнями на,отдельные кусочки и пассирование их на питательную стГеду Мурасиге-Скуга, в которую вводят дополнительно кине- тин в количестве 1,0-2,0 мг/л, 6- бенЗиламинопл ин в количестве 3,0- 5,0 мг/л, 1,0-2,0 мг/л аденина, 1,,0 мг/л гибберелловой кислоты 0,5- 0,7 мг/л ферулловой кислоты, 0,2 0,4 мг/л ИУК, 0,2-0,4 мг/л НУК, 0,2-0,4 мг/л ИМК, 0,1-0,3 мг/л 2,4 Д и культивируют до образования побегов с листьями, образовавшиеся растения- регенеранты пересаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую дополнительно 1,0-3,0 мг/л гибберел ловой -КИСЛОТЫ и 0,3-1,0 мг/л ШК, и культивируют до образования нормально развитых растений. Таблица 1

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использова^! но в селекционно-генетических работах с плодовыми культурами для получения гаплоидных расте>&шй. Целью изобретения является повымение выхода растений—регенерантов за счет индутсции морфогенеза каллуса. Поставленйая цель достигается тем, что пыльники эксплантируют на питательную среду Хеллера, содержащую дополнительно, мг/л: гидролизат казеина 500-800; дрожжевой экстракт 100—200^ 2,4/10,8-1,0} имк i,o~'i,5j КУК 1,0-3,о;'НУ К 1,0-1,5 и 6-БАП 0,1-1,0. Получен-^ ный каллус культивируют на питательной среде Мурасиге—Скуга, содержащей дополнительно, мг/л; 0,1f-0,9 кинетин; 4,0^6,0 гибберелловая кислота:, 4,0-6,0 ферулловая кислота ',0,5—1 ,5 6 БАП, ИУК-0,5-1,5 и НУК 0,5-1,5. Культивирование осуществляют до образования корневой системы, после чего каллусную ткань с корнями раздепяют на фрагменты, которые пересаживают для индукции побегообразования на питательную среду Мурасиге—Скуга,' содержащую дополнительно, мг/л: кинетин. f, 0-2, О; 6-БАП 3,0-5,0' аденин 1,0-2,0, гибберелловая кислота 1,О— 2,05 ферулловая кислота О,5-0,7i ИУК 0,2-0,4} НУК 0,2-0,4>&, КМК 0,2- - 0,4 и 2,4 Д 0,1-0,3. Полученные растения—per енеранты пересаживают на питательную среду Мурасиге—Скуга, содержащую дополнительно гибберелло- вую й;ислоту в количестве 1,0-3,0 мг/л, ИМК 0,3-1,0 мг/л. Культивируют до образования нормально развитых растений. 'Использование способа позволяет повысить выход растений-регенерантов до 80-92% от исходно взятых эксплан- 'тов. 2 табл.(ЛсVJ о00 N5

1. Ползчение каллусной ткани из пьтьников- на среде Хеллера2. Вызывание роста корней у пьтьцевьпс каллусов на среде Мурасиге и с;куга

0,3

0,2 5,0 6,0

6,0

5,0

Концентрация компонентов добавки экзогенных регуляторов роста в питательных средах и количество получаемых растений

Зо Стимуляция роста побегов с зелеными листьями н почками на среде Мзфасге и Скуга

Влияние модификахщй питательных сред на достижение положителького эффекта на каждом этапе процесса получения растений-регекерантов при культивировании пьшьников вигане-черешневого гибрида и в сравнении с прототипом

Продо11жение табл, 1

1,0

1,5 1,0 1,5 1,0 1,5

2,0 5,0 2,0 2,0

0,7 0,4 0,4 0,4 0,3

1,0

3,0

0,3 0,5 1,0

8-22 20-23

ли ц а Т

Частота каллу- сообразоваНИН из пьшькиков черешни составила 3,1-20,6% на среде Курасиге и Скуга, с КУК - 2 мг/л, ИУК - 8,5 мг/л, кинетика 0,6 мг/л

Клияние модификаций питательнъгх сред Tea достижение положитепького эффекта на каждом этапе процесса получения растекик-регенерантов при культивировании пыльников вишне-черешневого гибрида и в сравнении с прототипом

2, Вызывание роста корней у пьшьцевых каллусов на среде Мурасиге и Скуга

Таблица f.

В ряде.случаев наблюдали образование корней. Цифровые данные не приводятся,

Образойание побегов отсутствовало. граничными параметрами концентраций экзогенных регуляторов роста дополнительный эффект от их введения снижается на всех этапах осуществления способа в 2-3 раза.