Рекомбинантная плазмидная ДНК р 9 F МД, кодирующая гибридный полипептид Р199 - ASp PRo CYS CYS - VP1 /200 - 213/ - PRo PRo SeR PRo - Vp1 /131 - 152/ PRo CYS GLY и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI продуцент гибридного полипептида Р199 - ASp PRo CYS GLY - VP1 /200 - 213/ PRo PRo SeR PRo - VP1 /131 - 152/ - PRo CYS GLY Советский патент 1992 года по МПК C12N15/42 C12N1/21 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную In vitro рекомбинантную плазмидную ДНК.содержащую искусственный ген, кодирующий гибридный бепок, в состав которого входят

.антигенные детерминанты вируса ящура, промоторы ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок инициации трансляции, обусловливающий биосинтез поТипептидов. вызывающих при иммунизации экспериментальных животных обраэование вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. cod - продуцент этого полипептида.

Вирус ящура вызывает высококонтагиозное заболевание парнокопытных сельскохозяйственных животных, наносящее значительный ущерб странам с высокоразвитым животноводством. В настоящее время в качестве вакцины против ящура используют инактивированный вирус. Технология приготовления такой вакцины требует небезопасного крупномасштабного культивирования вирулентного вируса. Главным недостатком ее применения являются вспышки заболевания, вызванные неполностью инактивированным вирусом.

Вирус ящура представляет собой нукле- опротеид, состоящий из одной молекулы од- ноцепочечной значащей РНК и 60 копий каждого из капсидных белков VP1, VP2, VP3 -и VP4. Установлено, что поверхностный белок VP1 является главным антигеном и способен инициировать при вакцинации образование вируснейтрализующих антител. Однако полученный в чистом виде из вирусной частицы или технологией реком- бинантных ДНК белок VP1 вызывает слабый иммунный ответ,

Альтернативный подход к созданию субъединичных вакцин против вируса ящера вытекает из наблюдения, что синтетические пептиды, включающие амино-. кислотные последовательности 141-160 и 200-213 белка VP1 вызывают образование значительного уровня вируснейтрализующих антител при иммунизации этими пептидами в виде коньюгатов с белком-носителем. Однако и в этом случае иммуноген- ность наиболее активного из этих пептидов остается в 100-1000 раз ниже, чем иммуно- генность целого вируса, Отмеченные трудности в создании субъединичной вакцины можно преодолеть, используя для синтеза иммуногенного пептида технологию реком- бинантных ДНК.

Известна рекомбинантная плазмида pFMD65, кодирующая гибридный белок, в котором аминокислотная последовательность /J-галактозмдазы Е. coll соединена с повторяющейся последовательностью 141- 160 белка VP1 вируса ящура (штамм OiK). Методами ммунодиффузии и иммунофер- ментного анализа показано, что гибридный белок, продуцируемый бактериями, содержащими рекомбинантную пяазмиду рРМОбб. специфически связывается с антителами к целому вирусу ящура OiK и к фрагменту 136-148 капсидного белка VP1.

Известны рекомбинантные плазмиды рМ01-71, рМ01-72, рМ01-74 и рМ01-78, кодирующие гибридный белок, ч котором единичная или повторяющееся послёдовательности 137-162 поверхностного белка VP1 вируса ящура (штамм 01, BSF) слиты с последовательностью /8-галактозидазы Е. coli. Кодируемые этими плазмидами гибридные белки способны при иммунизации мор

ских евино/ вызывать появление вирусспецифических антител, взаимодействующих в иммуноферментном тесте и имму- ноблоттинге с рекомбинантным антигеном. Однако данные о способности получаемых

антител нейтрализовать вирус и предотвращать инфекцию отсутствуют.

По принципу конструирования рекомбинантная плазмида pFMD65, кодирующая гибрид /З-галактозидазэ -энтигенная детерминанта вируса ящура OiK - является наиболее близкой к предлагаемой.

Основным недостаткам перечисленных выше плазмидных конструкций является то, что все они кодируют гибридные белки, в

которых антигенные детерминанты соединены с / -галактозидазой Е. coll. Применение таких гибридов в качестве вакцин вряд ли возможно, поскольку сама бактериальная / -галактозидаза является достаточно

сильным иммуногеном; кроме того, доля пептидного фрагмента в таком сплавленном белке слишком мала, чтобы вносить существенный вклад в иммунный ответ.

Сконструирована рекомбинантная

плазмидная ДНК p9FMD, кодирующая биосинтез иммуногенного полипептида Р199, который индуцирует образование нейтрализующих антител против подтипа Ааа вируса ящура, и бактериальный штамм Е. coli

ВКПМ В-5296 - продуцент этого полипептида, обеспечивающий высокий уровень его биосинтеза.

Кодируемый плазмидой p9FMD имму- ногенный полипептид состоит из аминокислотной последовательности фактора некроза опухолей человека, соединенной своим С-концом с последовательностью универсальной антигенной детерминанты вируса ящура (последовательность 200-213

аминокислот белка VP1). которая, в свою очередь, посредством последовательности ProProSerPro, обеспечивающей изгиб полипептидной цепи, соединена с последовательностью главной вариабельной антигенной детерминанты вируса ящура (последовательность 131-152 белка VP1). Выбор последовательности антигенного полипептида обусловлен имеющимися в литературе данными по локализации главного

иммуногенного эпитопа вируса ящура и обеспечивает моделирование пространственной сближенности двух а-спиралей анти- генных детерминант, которое, по-видимому, имеет место в вирусной частице.:

Рекомбинантная плазмидная ДНК p9FMD, кодирующая иммуногенный полипептид Р199, характеризуется следующими признаками:-Г

кодирует аминокислотную после довательность гибридного белка: фактор некроза опухолей человека - AspProCysCys-VP 1 (200-21 ShProProSerPfo- VP1 (131-152)-ProCysGly;

имеет мол:м. 2,49 Мд (3,81 т.п.о.),

состоит из

5аиЗА1/Н1пс1111-фрагмента ДНК плазмиды pTNF314 Д. содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, полусинтетический ген фактора некроза опухолей человека с искусственным участком инициации трансляции/терминатор транскрипции.фага лямбда и ген /5-лактама- зы (3,66 т.п.о.).

SauSAI/HindII 1-фрагмента. содержаще- го синтетический ген, кодирующий пептиды антигенных детерминант вируса ящура (подтип А22):

содержит

в качестве генетического маркера ген / -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой p9FMD клеток Е. coli к пенициллиновымантибиотикам,

уникальные сайты узнавания рестрик- ционными эндонуклеазами. расположенными на следующих расстояниях вправо от сайта BstEH: BamHI - 73 нуклеотида, Bglll- 154 нуклеотида, Hlndfll - 229 нуклеотИдов, Ncol - 562 нуклеотида, Pstl - 2406 нуклеоти- дов.;

На чертеже изображены схемы лигаз- ных сшивок синтетических олигонуклерти- дов в двухцепочечные ДНК (сегменты А и В), кодирующие пептиды - антигенные детер- минанты белка оболочки VP1 вируса ящура (штамм Аа2). Для получения этих двухцепо- чечных ДНК амидофосфитным способом синтезируют одиннадцать олигонуклеоти- дов величиной от 13 до 43 нуклеотидных звеньев, которые затем соединяют при помощи ДНК-лигазы как указано на чертеже.

Для дальнейшего конструирования используют рекомбинантную плазмиду pTNF314 Л которая является производной плазмиды pTNF311 Л с измененной с помощью слигонуклеотид-направленного мутагенеза С-концевой частью искусственного гена фактора некроза опухолей человека. В результате в самый С-конец гена был введен уникальный для этой плазмиды ре- стриктный сайт Bglll. ДН-плазмиды pTNF314 Д расщепляют эндонуклеазами Bglll и Hlndlll, больший фрагмент выделяют и лигируют с избытком нефос- форилированного сегмента А. Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coll НВ101. Трансформанты высевают на LB- агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина. и скрининг колоний проводят гибридизацией „с 5 - 32Р -меченным олигонуклеотидом VII. Из гибридизующихся клонов выделяют плазмидную ДНК p7FMD, строение которой подтверждают рестриктным анализом с помощью эндонуклеаз Haelll и Mspl. а также определением нуклеотидной последовательности части плазмидной ДНК между сайтами рестриктаз Hind III и BamHI.

Для конструирования новой рекомби- нантной плазмиды p9FMD плазмидную ДНК p7FMD сначала линеаризуют гидролизом зндонуклеазы Pstl, а затем полученную таким образом линейную форму ДНК подвергают действию рестриктазы Kpnl. Из образовавшейся смеси фрагмент величиной около 2,2 т.п.о. выделяют электрофорезом в 1 %-ном геле легкоплавой агарозы. С другой стороны ДНК-плазмиды pTNF314 Дгидро- лизуют смесью рестриктаз Bglll n Pstl. Выделенный электрофорезом как описано выше Pstl/Bglll-фрагмент величиной около 1,6 т.п.о. лигируют в присутствии большого избытка синтетического сегмента В с Pstl/Kpnl-фрагментом ДНК плаэмиды p7FMD величиной около 2.2 т.п.о. Частью лигазной смеси трансформируют компетентные клетки Е. соН НВ101; трзсформанты высевают на 1,7% LB-arap, содержащий 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг проводят путем in situ гибридизации колоний с 51- Р -меченным олигонуклеотидом XII. Выделенную из гибридизирующихся колоний ДНК плазмиды p9FMO анализировали при помощи рестриктаз Mspl и Haelll и ее структуру подтверждали определением нуклеотидной последовательности в районе .клонирования сегмента В.

Рекомбинантная плазмида p9FMD кодирует иммуногенный пептид Р199, который представляет собой белок фактора некроза опухолей человека, слитый через дипептид AspPro с последовательностями антигенных детерминант подтипа А22 вируса ящура.

Для получения бактериального штамма - продуцентов иммуногенного полипептида

Р199 плззмидой pQFMD трансформируют компетентные клетки Е. coll SG20050.

Полученный таким образом штамм Е. coll ВКПМ В-5296 характеризуется следующими признаками..

Морфологические признаки. Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре Дифко колонии круглые, гладкие, прижаты, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте в жидких средах (на минимальной.среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40°С при оптимуме рН 6,8-7,0. В качестве источника азота испоЛьзуют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мк/мл), обусловленную наличием плаз- миды, а также к тетрациклину (до 30 мкг/мл), благодаря наличию транспозона.

Штамм Е. coll ВКПМ В-5296 обусловливает конститутивный синтез больших количеств (свыше 25% тотального клеточного, белка бактерий) иммуногенного пояипепти- да Р199, способного при иммунизации жи- вотных вызывать образование антител, нейтрализующих вирус ящура подтипа А22П р и м е р 1. Химический синтез и лигирование олигонуклеотидов.

Синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфорамидитным методом на ДНК-синтезаторе System 1 (Beckman) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3-конца к 5-концу с помощью защищенных фосфамидитов - метокситрил-М-ацил-2 -дезоксинуклеозид- 3-0-(метоксидиизопропиламино)-фосфи- тов, активированных тетраэолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стек- ло (размер пор 500 A,f размер пор 40-80 мкм), к которому через З -сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка J20-30 мкмоль/r). После проведения конденсации промывают смолу смесью тетрагидрофуран-пиридин-вода (5:3:2). По окончании синтеза защитные группы удаляли последовательной обработкой тиофеиолятом триэтиламмония и концентрированным аммиаком. При этом происходит отделение олигонуклеотида от носителя. 5 -Диметокси-тритильную группу удаляют кислотной обработкой, и олигонуклеотид очищают электрофорезом в 20% ПААГ, содержащем 7М мочевину. Выход- 1-5 о.е.

Лигазная сшивка. Смесь 250 пмоль каждого из нефосфорилированных олигонуклеотидов (I) и (VII) и 200 пмоль каждого из фосфорилированных олигонуклеотидов (II)- (VI) нагреваю ; 10 мин при 90°С в 100 мкл буфера содержащего 20 мМ трис-HCI, рН 7,5, и 10 мМ MgClg, затем медленно охлаждают до 15°С. прибавляют гАТР до концентрации 0,2 мМ, дитиотреит до концентрации 5 мМ и 100 ед. Т4 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15°С, затем депротеинизиру- ют двукратной фенольной экстракцией фенолом; ДНК высаживают этанолом и продукты сшивки выделяют при помощи электрофореза в 15% ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Нужный полинуклеотид выделяют из геля электроэлюцией на DEAE-бумагу DE-81, которую промывают несколько раз ТЕ-буфером (10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 0,5 мМ EDTA) и этанолом. Нуклеотидный материал элюируют при помощи 1,5 М раствора NaCI в ТЕ-буфере и обессоливают на колонке с сефадексом G-50. Выход сегмента А - 160 пмоль. Аналогичным образом получают сегмент В. Выход- 150 пмоль.

Л р и м е р 2. Конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК p7FMD.

Клетки бактерий Е. coll HB101, содержащие плазмидную ДНК pTNF314 Д, выращивают при 37°С в LB-бульоне. содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем плазмидную ДНК выделяют в соответствии с процедурой щелочной денатурации с модификациями, заключающимися в том, что к супернатанту, полученному после подкисления ацетатом натрия, прибавляют РНКазу А до концентрации 10 мкг/мл, смесь инкубируют 20 мин при 37°С, экстрагируют дважды смесью фенол-хлороформ (1:1) и ДНК высаживают этанолом. Осадок растворяют в ТЕ-буфере, содержащем 1 М NaCI, прибавляют полиэтиленгли- коль PEG-6000 до концентрации 1,5%, выдерживают 1 ч при 0°С, центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин; осадок промывают 70% этанолом, высушивают и растворяют в ТЕ-буфере. Выход плазмидной°ДНК определяют спектрофотометрически при 260 нм с использованием коэффициента экстинкции 20 о.е./мг.

К раствору 2 мкгплазмиды pTNF314 А в 30 мкл буфера R, содержащего 20 мм трис- HCI, рН 7,5. 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCfc, 7 мМ меркаптоэтанол, инкубируют со смесью рестриктаз Hlndlll и Bglll (no 10 ед. каждой) в течение 1 ч при 37°С. После инкубации реакцию останавливают двухкратной экстракцией смесью фенол-хлороформ (1:1) и векторный фрагмент очищают электрофоре- зом в 1 % геле легкоплавкой агарозы, ДНК выделяют методом замораживания - оттаивания и высаживают 70% этанолом. К раствору 0,2 мкг полученного таким образом вектора в 20 мкл буфера L, содержащего 20 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgCl2. 0,2 мМ гАТР и 5 мМ дитиотреит, прибавляют 0.1 Мкг сегмента: А и 20 ед. Т4 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 6ч при 15°С, затем ал и квоту (1/4) реакционной смеси используют Для трансформации компетентных Е.poll. Трансформацию проводят следующим образом. Предварительно клетки Е. colt НВт01 высевают на агар, содержащий среду Ш, 0,2% глюкозы и 2 мкг/мл тиамина. Единич- ную колонию вносят в 50 мл питательного бульона LB и выращивают при 37°С до мутности 0,3-0,5. Затем клетки охлаждают, осаждают центрифугированием (10 Мин, 5000 об/мин), промывают раствором 10 мМ MgCla. центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора CaCl2 и выдерживают при 0°С в течение 30 мин. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл 0.1 М СаОа и через 3 ч используют для трансфер- мациит С этой целью 5 мкл лигазной смеси смешивают с 50 мкл 0,05 М CaCIa, затем прибавляют 150 мкл суспензии компетент- ных клеток, выдерживают при 0°С. затем 2 мин при42°Си снова 10 мин при 0°С, после чего прибавляют 2 мл LB-бульона. инкубируют 1 ч при 37°С и аликвоты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл). Клоны бактерий, содержащие целевую плазмиду p7FMD, идентифицируют гибридизацией с одним из олигонуклеотидов 32P-VII, входящих в состав клонируемого сегмента А. Из гибриди- зующихся с этой пробой клонов выделяют плазмидную ДНК, строение которой под- тверждают рестриктным анализом с помощью рестриктаз Haelll и Mspl. Окончательно структуру рекомбинантной плазмиды p7FMD подтверждают определением нуклеотидной последовательности плазмиды в области вставки синтетической ДНК.

ПримерЗ. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pQFMD.

К раствору 10 мкг ДНК плазмиды p7FMD в 80 мкл буфера R прибавляют20ед. каждой из рестрикционных нуклеаз Pstl и Kpnl и инкубируют 90 мин при 37°С. Анализ полноты гидролиза и выделение векторного KpnI/Pstl-фрагмента (2,2 т.п.о.) проводят

при помощи электрофореза в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы. Одновременно 10 мкг ДНК плазмиды pTNF314 Д в 100 мкл буфера R обрабатывают 1,5 ч при 37°С 20 ед. каждой из рестриктаз Bglll и Kpnl, после чего фрагмент величиной около 1,6 т.п.о., содержащий синтетический ген антигенной детерминанты, выделяют при помощи электрофореза в 1% геле легкоплавкой агарозы как описано в примере 1. Далее этот фрагмент (0.2 мкг) соединяют в присутствии 0,3 мкг сегмента В с векторной ДНК (1,5 мкг) при помощи 30 ед. Т4 ДНК лигазы в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15°С. Десятую часть( реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coll НВ101. Трансформанты высевают на агари- зованную среду, содержащую ампициллин (50 мкг/мл). Скрининг бактериальных клонов, содержащих рекомбинантную плазмиду p9FMD, проводят гибридизацией колоний in situ с Р-меченным олигонукле- отидом (XIV). Из клонов, гибридизирующих- ся с радиоактивной пробой, выделяют плазмидную ДНК pQFMD, строение которой подтверждают гидролизом рестриктазами Mspl и Haelll, а также определением нуклеотидной последовательности в районе вставки синтетического дуплекса.

П р им е р 4. Получение штамма-продуцента иммуногенного полипептида, вызывающего образование антител, нейтрализующих вирус ящура подтипа А22.

Плазмидой p9FMD трансформируют компетентные клетки Е. coll SG20050 по методу, описанному в примере 1, и получают штамм Е. соН ВКПМ В-5296 - продуцент иммуногенного полипептида, вызывающего образование антител, нейтрализующих вирус ящура подтипа А22. Иммунные свойства полипептида из штамма-продуцента подтверждены иммуноблоттингом.

П р и м е р 5. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного полипептида Р199 (биологические испытания).

Для иммунизации лабораторных животных выделенный из биомассы штамма-продуцента рекомбинатный белок Р199 при определенной концентрации смешивают в равном объемном соотношении с неполным адьювантом Фрейнда.

Группе морских свинок или кроликов массой соответственно 0,5 или 2,0 кг вводят вакцинирующий раствор однократно или двукратно в объеме 1,0 мл в дозе 150-200 мкг.

Вторую иммунизацию проводят через 38-42 дня после первой. Вируснейтрализу- ющие антитела определяют на 47-60 день после первой иммунизации на культуре клеток свиной почки против 100 ТЦД50 вируса ящура подтипа А22.

На 47-55 день после первой иммунизации морских свинок заражают введением 500 ИДбО вируса ящура А22, адаптированного к организму морских свинок, и определяют протективный эффект.

Данные титрования вируснейтрализую- щих антител и протективный эффект приведены в таб. 1 и 2.

Таким образом, рекомбинантный белок Р199, выделенный из биомассы штамма- продуцента ВКПМ В-5296, обладает защитным действием против вируса ящура подтипа А22 и индуцирует высокий уровень вируснейтрализующих антител у кроликов и морских свинок.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК p9FMD, кодирующая гибридный полипептид P199-AspProCysCys - VP1 (200-213) - ProProSerPro-VP1(131-152)-ProCysGly. мол.м. 2,49 Мд и размером 3,81 т.п.о., содержащая SauSAI - Hfnd III - фрагмент ДНКплазмиды pTNF314 Дс тандемом промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, полусинтетическим геном фактора некроза опухолей человека и с искусственным

участком иницииации трансляции, термина- Top транскрипции фага лямбда и геном /J- лактамазы размером 3,66 т.п.;

Hind III - SauSAI - фрагмент с синтетическим геном, кодирующим пептиды -антигенные детерминанты вируса ящура подтип А22. генетические маркеры; ген Длактама- зы. обеспечивающий устойчивость пени- циллиновым антибиотиком; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, а расположенные на следующих расстояниях вправо от сайта BstEII: BamHI - 73 нуклеотида, Bgl II - 154 нуклео- тида; Hind lit - 229 нуклеотидов; Ncol - 562 нуклеотида, Pstl - 2406 нуклеотидов.

2. Штамм бактерий Esherichia coll ВКПМ В-5296 - продуцент гибридного полипептида Р199 - AspProCysCys VP1(200-213) - Pro ProSerPro-VP1(131-152)ProCysGly.

Изобретение относится к биотехноло гии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плэзмидную ДНК. содержащую искусственный ген. кодирующий гибридный белок, в состав которого входят антигенные детерминанты вируса ящура, промоторы ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок инициации трансляции, обуславливающий биосинтез полипептида, вызывающего при. иммунизации экспериментальных животных образование вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. соП-продуцент этого полипептида. Рекомбинантная плаэмидная ДНК p9FMD кодирует иммуногенный полипептид Р199, в котором аминокислотная последовательность фактора некроза опухолей человека своим С-концом соединена с последовательностью AspProCysCys- VP1()-ProProSerPro(131-152}-Pro CysGiy. Она состоит из Sau3Al/HInd III - фрагмента ДНК-плазмиды pINF 314. содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7. полусинтетический ген фактора некроза опухолей человека с искусственным участком инициации трансляции, терминатор транскрипции фага лямбда и ген /J-лактамазы и Sau3AI/Hlnd Ill-фрагмента, содержащего синтетический ген. кодирующий пептидные антигенные детерминанты вируса ящура (штамм А22). При трансформации плазмидной p9FMD компе тентных клеток Е.срН SG20050 получают штамм - продуцент иммуногенного полипептида Р199 вызывающего образование антител, нейтрализующих вирус ящура подтипа А22. 2 с.п.ф-лы, 2 табл.. 1 ил. xi СО 01

Результаты биологических испытаний рекомбинантного белка

Р199 на кроликах

Результаты биологических испытаний рекомбинантного белка Р199 на морских свинках

Таблица 1

Таблица 2

ABpProTyrGlyHtsGlyLysIleSerAlaGlyGlyMetGlyArgArgGlyAsp

1д IIX я IV

GATCCTAACGGTACCGGTAMTAGTCTGCTGGTGGTATGGGCGGTAGAGGAGAT- GATTGCCATGGCCATTTATGAGACGACCACCATACCCGGCATCTCCTCTAIIUV

LeuGluProLeuAlaAlaProCysGly PerTer

... t

CTAGAlcCTCTGGCTGCTCCTTGTGGTTAATA GATCTTGGAGACCGACGAGGAACACCAATTATTCGA U - . vii СЕГМЕНТ А

ABpfroCyaCystArgH iatyaGInLyal I el IeAloProA lа

GATCCTTGTTGTAGACACAAACAGAAAATCATTGCACCTGCA- GAACAACATCTCTGTTTGTCTTTTAGTAACGTGGACGTmи

LysGlnLeuLeuProProSerProAsnGlyHla

XIII

AAACAACTTTTGCCTCCTTCTCpTAACGGTAC TTTGTTGAAAACGGAGGAAGAGGATTGC

YIX СЕГМЕНТ В