Способ определения супероксиддисмутазной активности в крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/68 

регистрируют фоновое свечение (So). С помощью микродозатора в кювету автоматически вводятся 10 мкл раствора кверцетина в концентрации 0,1 мг/мл, приготовленного на диметилсульфоксиде. В ответ на добавку кверцетина развивается интенсивное свечение, которое через 1 мин выходит на постоянный уровень, который сохраняется в течение 15 мин и более. Производится подсчет интегрального свечения за 2 мин (Зд). Обычно величина SA составляла 1800- 2000 мв.

В первой серии опытов через 2 мин после кверцетина в кювету микродозатором добавляют по 20 мкл стандартных растворов СОД. На добавление СОД происходит резкое снижение интенсивности ХЛ. Подсчитывают светосумму свечения за 2 мин после добавления фермента (5в). При концентрации СОД в кювете 10 нг/мл SB была равна 370 мв, что составляет 19,5% от величины SB в отсутствии фермента. По результатам опытов с СОД сроят калибровочный график зависимости % ингибирования ХЛ от конечной концентрации фермента:

% ингибирования 100% SB

хЮО%

SA-SB

При соблюдении всех указанных условий 50% ингибирование ХЛ-реакции, сопровождающей аутоокисление кварцетина в щелочной среде, наблюдается при конечной концентрации СОД, равной 2 нг/мл. При спектрофотометрической. оценке такой же ингибирующей зффкт СОД наблюдается при 8 нг/мл фермента.

Для определения содержания СОД в крови человека вместо фермента в измерительную кювету люминометра автоматически добавляют 20 мкл супернатанта через 2 мин после кверцетина. Аналогичным образом рассчитывают % ингибирования ХЛ и по калибровочному графику определяют содержание СОД в исследуемых образцах крови.

Результаты анализа.

В крови пациента в начале анализа измерялось количество эритроцитов и содер- жание гемоглобина по общепринятым методикам. При расчете количества СОД в крови учитывается разведение цельной крови на всех стадиях приготовления СОД-со- держащих супернатантов и в ходе ХЛ-анализа.

Предлагаемый способом было измерено содержание СОД в крови 9 взрослых доноров в возрасте от 26 до 44 лет и 5 больных с гемолитическими анемиями.

В таблице приведены результаты исследования.

А работах разных авторов активность СОД соотносят таким показателям крови: к

числу клеток, на г гемоглобина, на мл цельной крови или эритроцитов, Первые два способа представления результатов по мнению большинства исследователей наиболее полно отражают изменения активности СОД в

0 крови. В то же время необходимо учитывать, что при некрторых заболеваниях (талласе- мии и дефиците железа в крови) значения активности при пересчете на г гемоглобина могут быть завышены. В таких случаях ак5 тивность СОД лучше выражать на число клеток. Учитывая эти обстоятельства, наши результаты представлены в 2-х разных формах. Средние значение активности СОД в крови здоровых доноров составили

0 1797±313 мкг/r гемоглобина или 11,7 ± ±4,0 нг/106 эритроцитов. По данным разных авторов активность СОД в крови равна 836, либо 267 мкг/г гемоглобина.

Таким образом, предлагается способ,

5 который позволяет определять содержание СОД в крови людей, обладает рядом преимуществ по сравнению с известными ранее:

высокой чувствительностью (для одного

0 измерения требуется 20 мкл капиллярной крови); наименьшая определяемая концентрация СОД составляет 0,5 нг/мл:

высокой специфичностью (регистрируются исключительно супероксидные ради5 калы, которые являются субстратом для фермента);

хорошей воспроизводимостью результатов (в параллельных пробах разброс показателей не превышает 0,5-1 %);

0 требуются малые затраты труда и времени (один анализ занимает-5 мин);

возможностью автоматизации при массовых обследованиях.

5 Формула из Обретения

Способ определения супероксиддисму- тазной активности в крови путем отбора крови, проведения гемолиза эритроцитов, добавления гемолизата в среду инкубации,

0 содержащую кверцетин, измерения кинетики окисления кверцетина с последующим подсчетом % ингибирования этой реакции в Сравнении с контролем, о тл и ч а ю щ и й- с я тем, что, с целью повышения чувстви5 тельности и точности, а также ускорения способа, гемолизат предварительно обрабатывают смесью хлороформ:этанол при соотношении гемолизат : смесь 1:2 по объему, центрифугируют, отделяют водно-спиртовую фазу и добавляют ее в среду инкубации, которая дополнительно содержит люциге- нин, измеряют кинетику окисления по хемилюминесценции с последующим расчетом % ингибирования свечения по калибровочной кривой.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения активности супероксиддисмутазы в хрови. Цель изобретения - повышение чувствительности и точности измерения активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) в крови человека. Для этого из крови пациентов получают экстракты/содержащие СОД. Измеряют люцигенин-зависимую хемилю- минесценцию, отражающую интенсивность образования супероксидных радикалов при аутоокислении кверцетина, и ингибирова- ние этого свечения СОД-содержащими экстрактами крови. По калибровочному графику, построенному для коммерческих препаратов фермента, определяют содержание СОД в исследуемых образцах крови. 1 табл. водно-спиртовая содержит супероксиддис- мутазу (СОД): интерфаза в виде тонкой пленки темно-красного цвета включает гемоглобин и нижняя - прозрачная, хлороформная, СОД на содержит. Осторожно отбирают верхнюю часть еупернатанта и переносят в отдельную пробирку, разводят в 50 раз 20 мМ фосфатном буфером (рН 7,8) и в дальнейшем используют для анализа. Отдельно приготавливают стандартные растворы коммерческой СОД (Beringher) с исходными концентрациями 800, 400. 200, 100. 50, 25 и 12,5 нг/мл. II. Проведение ХЛ-анализа. В кювету для измерения ХЛ добавляют 700 мкл среды, содержащей 20 мМ фосфатный буфер (NaH Р04-КН2Р04 100 мкМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат Na), 40-60 мкм люцигенина (Sigma), рН 9,6. Регистрация ХЛ производилась на люминометре 1KB 1251 (Швеция) в непрерывном режиме при температуре 27°С и постоянном перемещении содержимого кюветы. В течение 2 мил Ё О 00