Способ определения супероксиддисмутазной активности в биологическом материале Советский патент 1991 года по МПК G01N33/68 

1

(21)4730891/14 (22) 22,08.89 (46)15.12.91. Бюл. № 46

(71)Минский государственный медицинский институт

(72)Г.Н.Смелянская и А.И.Балаклеевский (53)612.015(088,8)

(56)J.B.C., 1972. v. 247, Мг 10, р. 3170.

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРОК- СИДДИСМУТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

(57) Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для определения супероксиддисмутазной активности в экспериментальных и клинических исследованиях, а также при оценке активности коммерческих препаратов фермента. Цель изобретения - повышение чувствительности и-специфичности способа - достигается эа счет использования 6-окси- дофамин в качестве субстрата аутоокисле- ния и° десфериоксамина в качестве хелатирующего агента. 4 ил.

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для определения активности супероксиддисму- тазы в биологическом материале в экспериментальных и клинических исследованиях, а также при оценке активности коммерческих препаратов фермента.

Цель изобретения - повышение специфичности чувствительности способа.

Цель достигается тем, что определение активности супероксиддисмутазы осуществляется путем инкубации содержащего ее биологического материала с б-оксидофами- ном и десфериоксамином (Десфералом) в фосфатном буфере при рН 7,0i7,5 с последующим фотометрированием, окрашенного продукта аутоокисления 6-оксидофамина.

На фиг. 1 представлена кривая зависимости степени торможения аутоокисления 6-оксидофамина в присутствии десфериок- самина от концентрации супероксиддисмутазы; на фиг. 2 - кинетика аутоокисления 6-оксидофамина в присутствии супероксиддисмутазы гемолизатэ эритроцитов крови крыс; на фиг. 3 - влияние агентов, связывающих ионы металлов с переменной валент ностью, на кинетику аутоокисления 6-оксидофамина; на фиг. 4 - влияние рН на активность супероксиддисмутазы гемолиза- та эритроцитов крыс.

Способ осуществляется следующим образом.

В пробу вносят 0,1 М раствор фосфатного буфера, рН 7,0-7,5, затем последовательно добавляют биологический материал, содержащий супероксиддисмутазу, раствор, содержащий 6-оксидофамин и десфе- риоксамин, до конечной концентрации . 2,5 10 М и 5 М соответственно. Содержимое пробы перемешивают и при комнатной температуре (18-25°С) регистрируют увеличение оптической плотности пробы при длине волны освещения 490 нм (максимум абсорбции) во времени или через определенный временной промежуток. Об активности фермента судят по степени торможения развития окраски, как принято в других известных методах.

Пример. Готовили следующие реактивы: 1-0,1 М фосфатный буфер с рН 7,5; 2-5

СО

с

ON Ю 00 VI 00 О

М раствор 6-оксидофамина на 0,01 М HCI, стабилизированный десфериоксамином (1 М), который готовится непосредственно перед опытом. Для этого приготовленную с точностью 0,01 мг навеску 6-оксидофаминбромида (2,5 мг), растворяют в 2 мл 0,01 М раствора HCI и добавляют 1,32 мг десфероксамина (М.М. 659), Раствор перемешивают и получают реактив 2 в количестве, достаточном для 20 проб.

Препарат, содержащий супероксиддис- мутазу (СОД) крови человека, готовят спосо- бом, предложенным J.M.McCord and I.Fridovlch.

К 0,1 мл эритроцитарной массы добав- ляют 2,9 мл 0,005 М трис-HCf буфера, рН 7,5. Оставляют на 0,5 ч в ледяной бане для образования гемолизата. К 1 мл гемолизата добавляют 0,4 мл смеси хлороформ - метанол (3:5), интенсивно встряхивают и центрифу- гируют 5 мин при ЗОООд.

Освобожденный таким образом от гемоглобина супернатант используют в качестве частично очищенного препарата СОД крови..

Для построения калибровочного графика, необходимого при расчете активности фермента по степени ингибирования аутоо- кисления 6-оксидофамина, готовят ряд проб, в которых к 1,5 мл реактива 1 добав- ляют различные объемы препарата СОД. содержащие разное количество фермента. Объем проб доводят до 1,9 мл 0,005 М трис- HCI буфером, рН 7,5. В контрольную пробу добавляют 0,4 мл указанного буфера вместо препарата, содержащего СОД. Реакцию начинают добавлением 0,1 мл реактива 2. Регистрируют изменение, во времени оптической плотности среды инкубации при длине световой волны 485 нм при комнат- ной температуре.

Исследования показали, что степень ингибирования окисления 6-оксидофамина в присутствии десфериоксамина меняется пропорционально концентрации суперок- сиддисмутазы, что позволяет построить нормальный калибровочный график зависимости степени ингибирования образования окрашенного продукта в среде от количества (концентрации) фермента для расчета его активности в общепринятых единицах.

Наличие десфериоксамина в исходном растворе 6-оксидофамина предохраняет последний от аутоокисления кислородом, растворенным в воде, что позволяет исключить процедуру деаэрации реагента. Одновременно в инкубационной среде десфериокса- мин ингибирует побочные реакции окисления 6-оксидофамина, не включающие его взаимодействие с супероксидным радикалом, что значительно повышает специфичность способа по сравнению с другими известными способами определения активности фермента.

Применение других известных хелато- ров ионов металлов, таких как этилендиа- мимтетраацетат (ЭДТА) и альбумин сыворотки крови, не предохраняет 6-окси- дофамин от аутоокисления, а напротив, ускоряет его и несколько снижает специфичность и чувствительность способа определения активности супероксиддисму- тазы. Наибольшая активность супероксид- дисмутазы, определяемая предлагаемым способом, проявляется при рН 7,0-7,5, что позволяет вести определение при рН, соответствующих его физиологическим показателям в крови и большинстве других тканей организма. Предлагаемым способом проведено определение активности супероксид- дисмутазы как в очищенных препаратах фермента, так и в частично очищенном биоматериале (освобожденном от гемоглобина гемолизате крови человека и животных, ге- могенате мозга).

Предлагаемый способ характеризуется высокой чувствительностью, точностью и специфичностью.

Формула изобретения Способ определения супероксиддисму- тазной активности в биологическом материале путем инкубации исследуемого образца, в буферной системе, содержащей донор су- пероксид-анионрадикала и хелатирующий агент, с последующим фотометрическим измерением содержания продукта аутоокисления донора под действием генерируемого им супероксид-анионрадикала, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности способа, инкубацию проводят в фосфатном буфере при рН 7,0-7,5, в качестве хелатирующего агента используют десфериоксамин, а в качестве аутоокисляющегося донора суперок- сид-анионрадикала 6 оксидофамин в концентрациях соответственно 5 . и 2,5 10 4М.

%% ингибирования

20

ингмбнрования

II Белок 1 г

25 ыкг-njfl

%% инпкйфования loo i

Л

ОД 0,5 % % ингибирования

90

1,0

0,1

0,5

1,0-1,5

ФигЗ

t Белок j

1,5

икг мл Апробы

С Белок 3

-9

,-1

2 мкг.м)11 пробы