Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для пбстановки иммуноферментного анализа (ИФА)с пирофосфатазой в качестве, индикаторного фермента..
Целью изобретения является получение гибридного штамма, продуцирующего мр ноклональные антитела (МКА) к пирофосфа-. тазе Е.соИ, пригодные для создания иммуноферментного анализа на OCfoee комплекса пирофосфатаза-антипирофосфата а.. / ,. ; :: -;
Штамм получают следующим образом.
Мышей линии Ва1Ь/с иммунизируютпо двухнедельной схеме 50 мкг пирофосфатазы E.coli в 0,15 М NaCI в сйеси с равным объемом полного адьюванта Фрёйнда дважды вводят внутрибрюшинно с интервалом в 7 дней- За 3, 2 и 1 день до слияния 25 мкг пирофосфатазы Е.соИ вводят внутрибрюшинно в 0,5 мл 0,15 М NaGI. Гибридизацию 1,2-10 клеток селезенки иммунных мышей и 3-10 клеток миеломы мыШи РЗХбЗ-Ад8.653 проводят 50%:ным раствором полизтиленгликоля мол.м. 4000, содержащего 5% диметилсульфоксида, в течение 1,5 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полизтиленгликоля, клетки высевают в96-луночные панели по 2 -10 спленоцитов в лунку. Для селекции гибридом используют
среду 1MDM (модифицированная Исковым среда Дульбекко) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 10 М гипоксантина, 4-10 М аминоптерина и 1,610 М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку. После 2 клонирований практически 100% субклонов продуцируют МКА к пирофосфатазе Е.соН. Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 15 пассажей в культуре.
Специфичность взаимодействия МКА с пирофосфатазой E.coli выявляют методом ИФА.
Штамм обозначают PFBI. Штамм PFBI хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток животных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК/П/442Д и характеризуется следующими признаками.
Культуральные признаки,
Среда для культивирования - 1MDM с 10% ЭТС, 2 мМ глутамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере 5% СОа. Посевная доза 2-10 клеток в мл.
Для выращивания гибридомного Штамма в асцитной форме пригодны мыши Balb/c, Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток щтамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5 миллионов в 0,5 мл среды 1MDM. Асцит формируется через 12-14 дней.
Продуктивность штамма.
Через 3-4 дня концентрация антитела в Культуральной жидкости достигает 11-12 мкг/мл. Концентрация антитела в асцитной жидкости достигает 4-5 мг/мл. Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует моноклональные антитела IgGI. Специфичность-пирофосфатаза E.coli.
КЬнтаминация. Бактерии и грибки в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выяв;1ено по характеру включения тимидиновой метки.
Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: 1°С в минуту до -70°С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяной бане при , Жизнеспособность клеток
после размораживания 55-60% по окрашиванию трипановым синим.
Пример Для определения специфичности взаимодействия МКА с пирофосфатазой Е.соИ используется метод ИФА. Козьи антимышиные антитела (Caiblochem), разведенные до 0,5 мкг/мл, в 50 мкл 0,1 М карбонатного буфера рН 9,6 вносят в лунки 96-луночных микроплат и сорбировуют ночь
0 при 4°С. После отмывки в лунки вносятпо 50 мкл культуральной среды штамма PFBI и параллельно культуральную среду штамма гибридомы ЗЗБ1.2, продуцирующей антитела к липополисахариду E.coli, а также
5 супернатант спленоцитов мыши стимулированных ФГА (фитогемагглютинином) In vitro. Панель инкубируют 1ч при 20°С, затем отмывают и вносят по 1 мкг на лунку пирофосфатазы E.coli в 50 мкл 0,01 М Трис-НС1 .
0 буфере, рН 7,4, 0,05 MNaCI, 0,05% Твин-20, 0,1% поливинилпирролидона. Послеинкубации в течение 1 ч при 20°С панельотмывают и в лунки добавляют субстрат пирофосфат, 30-50 мкМ в 0,05 М Трис-НС1
5 буфере, рН 9,0, 0,5 мМ MgCl2 и инкубируют 20 мин при 37°С. Окрашивание лунок учитывают после добавления раствора, содержащего молибдат аммония и малахитовый зеленый на спектрофотометре при длине
0 волны 620 нм
Результаты опыта по определению специфичности связывания МКА, продуцируемого клетками штамма PFBI с пирофосфатазой Е.соН, представлены в табл.1.
5 Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности МКА, вырабатываемого клетками штамма PFBI, и показывают возможность использования этих МКА для.сорбции пирофосфатазы из
0 раствора с сохранением ее ферментативной активности.
П р и М е р 2. Определение антигена в твердофазном ИФА с применением комплекса пирофосфатаза-антипирофосфатаза
5 является аналогом ИФА с применением комплекса пероксидаза-антипероксидаза (ПАП-метод).
Антиген, фактор некроза опухоли-а человека (ФНО-а), в концентрациях от 2мкгдо
0 20 нг/мл в 100 мкл 0,1 М карбонатного буфера рН 9,6 вносят в лунки 96-лунЬчный микроплат и сорбируют в течение 12-18 ч при 4°С. После отмывки в микроплать добавляют по too мкл/лунку 0.01 М Трис-НС1
5 буфера, рН 7,4; 0,05 М NaCI, 0,05% Твин-20,. 0,01% поливинилпирролидона и инкубируют 30 мин при 20°С для блокирования мест неспецифической сорбции белков. Этот же буфер применяется для приготовления всех последующих реагентов и отмывки. Затем в
лунки микроплат вносят по 100 мкл мышиных МКА к ФНО-а в концентрации ТО мкг/мл и инкубируют 1 ч при 20°С. Микроплаты отмывают, добавляют по ТОО мкл/лунку антимышиные антитела (набор для иммунодиагностики Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР) и инкубируют 1 ч при 20°С. Далее в отмытые лунки микроплат в объеме 10 мкл добавляют преформированный комплекс пирофосфатаза-антипирофосфатаза (20 мкг/мл пирофосфатазы, 10 мкг/мл МКА к пирофос фатазе) и инкубируют при тех же условиях. В качестве субстратного раствора доба1вляют 0,05 М Трис-На, рН 9,0, 0,5.мМ MgCh. содержащий пирофосфат в концентрации 30-50 мкМ и инкубируют 10-30 мин при 37°С.
В табл.2 представлены .результать опыта с использованием набора для иммунодиагностики с помощью комплекса пероксидаза-антипероксидаза.
Как видно из данных табл.2 антитела продуцируемые штаммом PFBI, являются пригодными для использования их в ИФА на основе комплекса пирофосфатаза-антипирофосфатаза. Чувствительность данного анализа при определении ФНО-а человека составляют 30 нг/мл. Пирофосфатаза имеет ряд преимуществ по сравнению с другими ферментами, применяющимися в качестве индикаторной метки, а именно цветовой переход в случае пирофосфатазы благоприятен для визуальной оценки и позволяет регистрировать поглощение, превышающее фоновое всего на 0,1 оптической единицы,, константа Михазлиса, характеризующая пи.рофосфатазную реакцию иа три порядка ниже, чем для реакций пероксидазы и щело1 ной фосфатазы, что позволяет резко сократить расход субстрата, благодаря высокой термостабильности пирофосфатазы ИФА можно проводить при температурах до 60°С, что в несколько раз сокращает продолжительность анализа и увеличивает его специфичность.
Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L ВСКК/П/М442Д-продуцент моноклинального антитела к пирофосфатазе Escherlhta coli.
Таблица 1
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для создания иммуноферментного анализа на основе комплекса пирофосфатаза-антипирофосфа- таза. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемыхклеток мыши, продуцирующего монокло- нальные антитела (МКА) к пирофосфатазе Eseherihia colt. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Ва1Ь/с, иммунизированных препаратом пирофос- фатазы Е.соИ. с клетками миелом.ы мыши Р3х63-Ад8.653. Клетки культивируют в среде ШОМ (модифицированная Исковым среда Дульбекко) с добавлением 10%- ной эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С в атмосфере 5% СОа. Штамм обозначен PFB1 и депонирован под номером ВСКК(П) 4220. Штамм продуцирует моноклрнальное антитело IgCI изотипа, связывающееся с пиг рофосфатазой Е.соП. СодержаниеМКА'В 1 мл культуральной среды и 1 мл асцитнрй жидкости составляет соответственно 11-12 мкг и 4-5 мг. МКА могут быть использованы для создания иммуноферментного анализа на основе комплекса пирофосфатаза-антипи- ро.фосфатаза. 2 табл.•
Таблица 2
| Аналогов в Научно-технической и Натен- тной литературе не обнаружено. |
