Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии и касается получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела (МКА) к легким цепям иммуноглобулинов кролика, которые могут быть использованы для создания универсаль ного антиаидового кроличьего конъю- гата, необходимого при определении активности гипериммунных кроличьих сывороток в иммуноферментном анализе.
Аналогов в патентной и научно- технической литературе не обнаружено.
Штамм получают следующим образом. Белых мышей Balb/c (масса 14-16 г) иммунизируют иммунохимически чистыми легкими цепями IgG кролика еженедельно, вводя внутрибрюшинно по 250 - 300 мкг антигена на мышь в смеси с адъювантом Орейнда. За 4 дня до гибридизации мышам в течение трех дней подряд вводят антиген внутривенно в той че дозе без адюъванта. Затем извлекают селезенку и используют ее для выделения иммунных спленоцитов. Слияние клеток миеломы и иммунных спленоцитов в соотношении 1:5 проводят с помощью 50%-ного полиэтиленгли- коля с м.м. 1000. После слияния взвесь клеток в концентрации () х105 в 1 мл переносят в 96-луночные панели по 200 мкл на фидерный слой перитонеальных макрофагов мыши, полученный в течение 1-2 суток, клетки инкубируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% -СОг.
Ч
XI
00
Јь
Селекцию гибридом осуществляют на селективной среде ГАТ, содержащей ги- поксантин ( (Г М),аминоптерин (k x х1СГчМ), тимидин (1,6 10-5М), с последующим 3 кратным рекламированием методом лимитирующих разведений. Первичный скрининг гибридом проводят через 21-30 дней инкубации для определения продукции специфических антител в иммуноеЬерментном анализе (ИФА) с использованием планшетов, активированных легкими цепями IgG кролика и меченных пероксидазой антител к белкам сыворотки мыши. В качестве контроля используют сыворотки мышей, содержащие антитела к легким цепям иммуноглобулинов кролика в высоких титрах. Отбирают и последовательно размножают клон гибридных клеток, наиболее стабильно продуцирующий МКА необходимой специфичности в луночных панелях, а затем в культу- ральных флаконах возрастающего объема.
Полученный штамм обозначают N15. Он депонирован 16.05.90 г. в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Все- союзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК(П) 489Л и характеризуется следующими признаками.
Культуральные признаки. Клетки штамма N15 культивируют в среде КГМ1-1б О с добавлением м; 1-глутамина и 10-15% сыворотки плода коровы. ЛРЯ селекции гибридных клеток в ростовую среду добавляют
10
15
20
25
30
35
1 -10
-4
М гипоксантина, k
аминоПродуктипность штамма и характеристика полезною продукта. Штамм N15 продуцирует МКА к легким цепям 7 и X иммуноглобулинов кролика. СпецисЬичность МКА подтверждается методами ИОА и иммуноблотинга. Титр антител в культуральной жидкости сос тавляет 1:6, в асцитной - 1:2560 (непрямой ИОА). Стабильность продукции антител сохраняется на протяжении 21 пассажа in vitro (срок наблюдения) .
Контаминация штамма. При исследовании клеток штамма N15 на наличие посторонних агентов микробиологическим и электронномикроскопическим методами бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены.
Криоконсервирование и реконсерва- ция. За сутки до криоконсервирования проводят смену ростовой среды на све жую. Среда замораживания: 5% конди ционированной среды, 5% эмбриональной сыворотки, 10% диметилсульфокси- да. Режим замораживания - с Ц°С до -25 С со скоростью 1 градус в минуту, затем - до 70°С по 5°С в минуту ампулы с клетками следует выдержать при такой температуре в течение 10 мин, хранить в жидком азоте при -196°С.
Реконсервация - на водяной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживания при окрашивании трипановым синим составляет 88%. Спо собность продуцировать антитела сохраняется на прежнем уровне.
Пример 1. Планшеты /для ИФА
птерина и 1,6 -10 М тимидина. Гибри- активируют препаратом иммунохимичес- дому культивируют как в пластиковых, кичистых легких цепей иммуноглобулицепей иммуноглобулинов кролика, режим активации: концентрация белка - 0 мкг/мл, наслаивающий буферный раствор - карбонат- бикарбонатный буфер рН , время ин кубации - 18 ч при 4°С. После отмыва ния планшетов от несвязавшегося белка (6 рал поочередно водопроводной водой и дистиллированной водой с 0,05% твина-20) в лунки вносят иссле дуемые пробы культуральной жидкости с продуктами жизнедеятельности гибридного клона N15, а также положительный (сыворотка мышей, иммунизиро ванных легкими цепями иммуноглобулинов i„ролика) и отрицательный (куль- туральная жидкость, не содержащая продуктов жизнедеятельности гибридом контроли (К+ и К- соответственно).
так и в стеклянных сосудах, оптимальная посевная доза 100-200 тыс. клеток в 1 мл, кратность рассева 1:2 - 1:7 интервалы между пассажами 2-3 суток. Культура суспензионная, стационарная. Клетки обладают хорошей адгезивной способностью, легко снимаются со стенок сосуда встряхиванием и пипетиро- ваиием без применения растворов трипсина либо версена. Гибридому N15 культивируют в брюшной полости мышей линии Balb/c, предварительно прайми- рованных неполным адъювантом Фрейн- да. Образуются асцитные или солидные опухоли. Асцитные опухоли продуцируют асцит в течение 8-18 дней, начиная с дня после инокуляции 1- 10 млн. клеток на животное.
5
0
5
0
5
Продуктипность штамма и характеристика полезною продукта. Штамм N15 продуцирует МКА к легким цепям 7 и X иммуноглобулинов кролика. СпецисЬичность МКА подтверждается методами ИОА и иммуноблотинга. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:6, в асцитной - 1:2560 (непрямой ИОА). Стабильность продукции антител сохраняется на протяжении 21 пассажа in vitro (срок наблюдения) .
Контаминация штамма. При исследовании клеток штамма N15 на наличие посторонних агентов микробиологическим и электронномикроскопическим методами бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены.
Криоконсервирование и реконсерва- ция. За сутки до криоконсервирования проводят смену ростовой среды на свежую. Среда замораживания: 5% кондиционированной среды, 5% эмбриональной сыворотки, 10% диметилсульфокси- да. Режим замораживания - с Ц°С до -25 С со скоростью 1 градус в минуту, затем - до 70°С по 5°С в минуту, ампулы с клетками следует выдержать при такой температуре в течение 10 мин, хранить в жидком азоте при -196°С.
Реконсервация - на водяной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживания при окрашивании трипановым синим составляет 88%. Способность продуцировать антитела сохраняется на прежнем уровне.
активируют препаратом иммунохимичес- кичистых легких цепей иммуноглобули0
5
цепей иммуноглобулинов кролика, режим активации: концентрация белка - 0 мкг/мл, наслаивающий буферный раствор - карбонат- бикарбонатный буфер рН , время инкубации - 18 ч при 4°С. После отмывания планшетов от несвязавшегося белка (6 рал поочередно водопроводной водой и дистиллированной водой с 0,05% твина-20) в лунки вносят исследуемые пробы культуральной жидкости с продуктами жизнедеятельности гибридного клона N15, а также положительный (сыворотка мышей, иммунизированных легкими цепями иммуноглобулинов i„ролика) и отрицательный (куль- туральная жидкость, не содержащая продуктов жизнедеятельности гибридом) контроли (К+ и К- соответственно).
Прополят инкубацию п течение 3 ч при 37°С, отмывают несвязавшиеся белки как описано выше и проявляют образовавшиеся иммунные комплексы с помощью иммунойерментного конъюгата, представляющего собой меченные перокси- дазой кроличьи антитела к иммуноглобулинам мьими (рабочее разведение конъюгата - 1:1000, время инкубации - 1 ч при 37°С). После окончания инкубации в лунки планшета вносят субстратную смесь, представляющую собой 0,0 t% раствор ортосЬенилендиамина на цитратном буфере рИ ,,1 с добавлением 0,03% перекиси водорода: реакцию останавливают путем добавления в каждую лунку 60 мкл 50% серной кислоты посте достаточно выраженного (визуальный контроль) изменения окраски в лунках с испытуемыми пробами.и К+, оптическую плотность продуктов ферментативной реакции измеряют с помощью спектрофотометра с вертикальным ходом луча типа Uniscan.
Определение титров МКА в культу- ральных и асцитных жидкостях в ИФА проводили по методике, аналогичной вышеописанной,но исследуемые пробы в этом случае вносили в различных разведениях (от 1:2 до 1:256 или от 1:20 до 1:2560) и параллельно растит- ровывали положительный и отрицательный контроли. За титр исследуемой пробы принимали то ее последнее разведение, значение оптической плотности (ОП) в котором не менее, чем в два раза превышало величину ОП соответствующего рпвведения отрицательного контроля (при непрерывном условии: абсолютная величина ОП в этом разведении не должна быть меньше 100).
Результаты исследований представлены в таблице.
Пример 2. Проводят электрофорез в 10%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) иммунохимически чистого кроличьего IgG, предварительно прокипятив его в течение 3 мин в буфере, содержащем 0,1% додецилсульфата натрия и 2% бета-меркаптоэтанола. Такая обработка приводит к разрыву межцепочечных связей в молекуле IgG с разведением ее на тяжелые и легкие цепи. Параллельно с IRG кролика электрофорезу в ПАЛГ подвергают смесь белков с известной мол. массой (маркеры с мол. массой от до D) ,
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
что позволяет точно определить после завершения электрофореза положение легких цепей If G.
После электрофореза белки переносят на нитроцеллюлозный фильтр с помощью прибора для электропереноса: на регулировочные винты горизонтально расположенного основания камеры помещают нижнюю титановую пластину,
наливают в камеру 1,5 л буфера для электропереноса (трис-глициновый буфер, рН 8,6, смешанный в равных час- тях с метанолом и разведенный дистиллированной водой в 5 раз) затем последовательно собирают сэндвич - нижняя мягкая прокладка, прокладка из Фильтровальной бумаги, пластинка полиакриламидного геля с электрофс/т ретически разделенными молекулами тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов кролика, мембрана, на которую производится перенос (нитроцеллюлозный фильтр), верхняя прокладка из Фильтровальной бумаги, верхняя мя|- кая прокладка, верхняя титановая пластина. Каждый слой укладывают осторожно, следя за тем, чтобы между слоями не попали пузырьки воздуха. После того, как сэндвич готов, камеру герметично закрывают, ставят вертикально и подключают источник питания: отрицательный полюс со стороны геля, положительный - со стороны мембраны. Перенос проводят в течение при напряжении 20-30 В.
После окончания переноса сэндвич осторожно разбирает в обратной последовательности и мембрану с перенесенными на нее белками помещают в 0,02М трис-HCl буфер рН 7,5 с 0,15 М NaCl и 2% бычьего сывороточного альбумина (буфер 1) на 30 мин. Затем мембрану высушивают и разрезают на узкие полоски (примерно 0,5 см), которые помещают в буфер 2 (буфер 1 с добавлением 0,05% твина-20) на 30-60-мин, после чего полоски мембраны погружают в раствор исследуемых моноклояаль- ных а нтител (последние предварительно разводят буфером 2 до концентрации белка 50 мкг/мл), проводят инкубацию в течение 18-2 ч при 4°С, далее полоски мембраны отмывают 5 раз буфером 2 и заливают рабочим раствором иммуноферментного конъюгата (меченные пероксидазой антитела к IgG мыши в разведении 1:500) -на b часа при комнатной температуре. После
7177818
окончания инкубации пластин с конъю- гатом их отмывают 5 раз по 5 мин буфером 2 и 3 раза по 5 мин 0,02 М трис НС1-буфером рН /,5. Проявление образовавшихся иммунных комплексов проводят с помощью раствора -хлор- нафтола и диаминобензидина в метаноле с добавлением перекиси водорода (0 мин). В зоне взаимодействия МКА и легких цепей проявляется полоса коричневого цвета.
Таким образом, полученные МКА могут быть эффективно использованы для
8
получения универсальных ангивидовых кроличьих конъюгатоа, необходимых при тестировании активности гипериммунных кроличьих сывороток в иммуно - Ферментном анализе.
Оормула изобретения
10
Штамм гибридных культивируемых клеток Mus nusculus L. ВСКК (П) № kQS Д, используемый для получения моноклональных антител к легким цепям иммуноглобулинов кролика.
Определение титров МКЛ в культуральной и асцитной жидкостях
8
получения универсальных ангивидовых кроличьих конъюгатоа, необходимых при тестировании активности гипериммунных кроличьих сывороток в иммуно - Ферментном анализе.
Оормула изобретения
Использование: биотехнология и медицинская диагностика на основе им- муноферментного анализа. Сущность изобретения: получение штамма гибридных клеток мыши, продуцирующего моно- клональные антитела (МКА) к легким цепям иммуноглобулинов кролика. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками мышиной миеломы Sp 2/0. Титр МКА в куль- туральной жидкости составляет 1:64, а в асцитной - 1:2560. МКА относятся к IgO, они специфически взаимодействуют с антигенными детерминантами легких цепей X и А иммуноглобулинов кролика. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении 21 пассажа in vitro. 1 табл. сл
