Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L, используемый для получения моноклональных антител к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения инсулина.

Известно большое количество гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к инсулину. Однако значительная часть гибридом синтезирует моноклональные антитела к инсулину быка, которые со значительно меньшим сродством взаимодействуют с инсулином человека, или к инсулину человека, которые менее эффективно взаимодействуют с гормоном другой видовой принадлежности. Наиболее широко используют инсулин свиньи. Это обусловлено тем, что инсулин свиньи отличается от инсулина человека только одним аминокислотным остатком, что снижает вероятность побочных реакций при терапевтическом лечении.

Поэтому для иммунодиагностики, а также регулярного определения концентраций инсулина необходимы препараты монокло- нальных антител, способные в одинаковой степени хорошо взаимодействовать как с инсулином свиньи, так и с инсулином человека.

Наиболее близок к предложенному штамм гибридных клеток, синтезирующий моноклональные антитела к инсулину свиньи (1), обозначенный как 5Н. 1В. 10D. Однако данные антитела не взаимодействуют с инсулином человека.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, используемого для получения монокло- нальных антител с более высокой константой афинности, взаимодействующих с инсулином человека, на основе которых может быть создан высокочувствительный ди- агностикум для определения инсулина.

Штамм получают следующим образом.

В качестве иммуногена используют препарат инсулина свиньи. 4-недельных мышей линии Balb/c иммунизируют в течение месяца 3 раза 30 мкг инсулина. При первой инъекции раствор инсулина суспендируют в равном обьеме адъюванта Фрейнда, последующие инъекции проводят без него. Титр антител в сыворотке крови животных, определяемый методом ELISA, 1:15000. Зачеты- ре дня до слияния мышей иммунизируют раствором инсулина в физиологическом растворе. Через 4 дня у мыши в стерильных условиях извлекают селезенку, гомогенизируют в физиологическом растворе, содержащем 10% глюкозы, и оставляют стоять 3 мин. Грубый осадок отбрасывают а взвесь клеток переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 8 мин при 800 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок суспендируют в 50 мл физиологического раствора. Повторно центрифугируют в тех же условиях. Эту операцию повторяют дважды. Аналогичным образом трижды промывают физиологическим раствором клетки миеломы линии Sp2/0. затем спленоциты смешивают с клетками миеломы в соотношении 10:1 и осаждают центрифугированием. Надосадочную жидкость сливают и к осадку медленно по каплям добавляют 1 мл 50%-ного полиэтиленгликоля в физиологическом растворе, содержащего 10% диме- тилсульфоксида. Через 3 мин медленно в течение 5 мин добавляют физиологический раствор, содержащий глюкозу, до объема 50 мл, Клетки осаждают центрифугированием и осадок суспендируют .в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ДМЕМ), содержащий 10% сыворотки плода коровы (СПК) скота, 3,5 мМ глутамина, 17,5 мкМ пирувата натрия, 50 мкМ 2-меркаптозтано- ла, 100 мкМ гипоксантина, 16 мкМ тимиди- на, 0,4 мкМ аминоптерина. Клетки распределяют в пяти 96-луночных панелях для микротитрования (Dynatech) и культивируют в С02-термостате при 37°С и содержании в атмосфере 5% С02. Через 5 дней клетки подкармливают, убирая из каждой лунки 50 мкл среды и добавляя 50 мкл свежей. Через 2 недели после начала слияния тестируют культуральную жидкость на моноклональные антитела методом ELISA. Гибридомы, положительные по результатам тестирования, помещали в среду, содержащую все указанные компоненты, за исключением аминоптерина (НТ-среда). Клетки наращивают в 24-луночных панелях для микротитрования, часть клеток замораживают, а остальные трижды клонируют в полужидком агаре. Клонирование гибридо- мы повторяли трижды. Клонированную гиб- ридому 6Е 6G 2А перевивают на мышах Balb/c для получения асцитной жидкости.

Полученный штамм гибридных клеток продуцирующий моноклональные антитела к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи, депонирован в спе0 циализированой коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под № ВСКК (П) 420 Д и характеризуется следующими признаками.

5 Культуральные свойства. Для выращивания штамма используют культуральные флаконы. Во флакон с 3 мл среды DMEM, содержащей 10% СПК, 3,5 мМ глютамина, 17,5 мкМ пирувата натрия и 50 мМ 2-меркап0 тоэтанола, засевают 250000 клеток гибридо- мы 6Е. 6G. 2А и проводят пассирования 1 раз в 4-5 дней с подсчетом клеток. Для получения асцита мышам BALB/c за 7 дней во введения гибридомных клеток в/б вводят

5 0,5 мл 2,6,10,14-тетраметилпентадекана. На 7 день животным в/б инъецируют по 500000 клеток, Асцитную жидкость собирают на 12- 14 день. Объем асцита 5-6 мл. Клетки из асцита перевивают в течение 8-10 пассажей

0 без заметного изменения титра монокло- нальных антител васцитной жидкости.

Характеристика полезного продукта. Моноклональные антитела относятся к lgG2a. Константа аффинности .

5 Кариологическая характеристика штамма: Модальное число хромосом 80. Маркерных хромосом не выявлено.

Продуктивность штамма. Концентрация моноклональных антител в культуральной

0 жидкости на 7-ой день культивирования 40 мкг/мл в асцитной жидкости 5-8 мг/мл при определении по методу Лоури и с помощью ELISA.

Криоконсервирование. Клетки штамма

5 ресуспендируют в смеси, содержащей 10% ДМСО, 30% СПК и 60% среды ДМЕМ, в концентрации 1х606 клеток на 1 мл. разливают при 4°С в пластиковые ампулы, помещают в полиуретановые контейнеры и

0 переносят в холодильник (-70)°С на 18 ч. Затем клетки переносят в жидкий азот на длительное хранение. Размораживают при 37°С в водяной бане. Жизнеспособность клеток оценивают путем окрашивания три5 Пановым синим: она составляет 60%.

Контаминация, При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен. Пример 1. Моноклональные. антитела используют для определения концентрации

инсулина методом иммуноферментного анализа. В 96-луночные полистироловые панели для микротитрования помещают 100 мкл (10 мкг/мл) раствора моноклональных антител в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,0, и инкубируют 2 ч. Затем в каждую лунку добавляют 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА) в том же буфере и инкубируют 2 ч. Лунки промывают 0,015 М фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCI и 0,05% твин-20 (ФБТ). К адсорбированным -на полистироле моноклональным антителам добавляют 100 мкл раствора, содержащего исследуемый образец инсулина и конъюгат инсулина с ковалентно пришитой к нему пероксидазой в ФБТ. В контрольные лунки помещают аналогичный образец, но не содержащий инсулин. Инкубируют 1 ч при 37°С. Промывают ФБТ и добавляют в каждую лунку субстратную смесь: 0,03% Н202, 2 мМ ABTS (2,2-азинодиэтилбензоти- озолин-6)-сульфоновая кислота, 0,05М цит- ратный буфер рН 4,0. Оптическую плотность определяют при 412 нм на специальном автоматическом устройстве. Концентрацию инсулина вычисляют по построенной в параллельном эксперименте калибровочной кривой, полученной как описано выше, добавляя в лунки панелей известные концентрации инсулина.

Чувствительность определения инсулина 30 пкг гормона/мл. Специфичность взаимодействия моноклональных антител с инсулином оценивают методом конкурентного иммуноферментного анализа в следующей системе. К моноклональным антителам, адсорбированным на полистироле, добавляют инсулин свиньи, меченный пероксидазой, а также немеченый инсулин человека и быка. Специфичность моноклональных антител оценивают по проценту ингибирования связывания конъюгата инсулин-пероксидаза, немеченым инсулином свиньи в качестве конкурирующего агента.

0

5

Моноклональные антитела 6E.6G.2A одинаково эффективно взаимодействуют с инсулином человека и свиньи, однако для ингибирования связывания конъюгата инсулин свиньи-пероксидаза на 50% требуются в 10 раз более высокие концентрации инсулина быка, чем немеченого инсулина свиньи и человека. Таким образом, полученные моноклональные антитела могут быть использованы для количественного определения инсулина человека.

П р и м е р 2. Моноклональные антитела 6E.6G.2A могут быть использованы для обнаружения инсулина методом блоттинг-гиб- ридизации. На нитроцеллюлозную

мембрану наносят 10 - М инсулина, растворенного в 0,15 М ФБР, инкубируют 1 ч при 37°С, а затем 1 ч в 20%.СПК. После этого отмывают в растворе ФБРТ, и нитро0 целлюлозную мембрану помещают в рас- твор, содержащий моноклональные антитела к инсулину, растворенные в концентрации 0,01 мг/мл в ФБРТ. Инкубируют 1 ч при 37°С 1 ч, затем отмывают ФБРТ.

5 Затем нитроцеллюлозную мембрану помещают в ФБРТ, содержащий конъюгат кроличьих Ig к антителам, мыши, меченных пероксидазой (в концентрации 2 мкг/мл по пероксидазе). После отмывания ФБРТ до0 бавляют субстрат диаминобензидин (2 мг/мл) в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 0,2% CoCte 2,6 мМ НзОа. О результатах реакции судят по появлению окрашенного нерастворимого продукта ре5 акции в местах локализации иммунофер- ментных комплексов.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L ВСКК (П) Ms 420Д, используемый для получения моноклональных антител к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи.

Использование: штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. BCKK (П) № 420. продуцирующий моноклональные антитела (МКА) к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи, используемый для количественного определения инсулина с помощью иммуно- ферментного анализа (ИФА) или иммуноб- лоттинга. Сущность изобретения: получение МКА с повышенной константой аффинности к инсулину. Штамм получают в результате гибридизации спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками миеломы Sp2/0. Среда для культивирования: D MEM с 10% СПК. Схема пассирования:.один раз в течение 4-5 дней in vitro. В виде асцита клетки перевивают в течение 8-10 пассажей. Концентрация МКА в культуральной жидкости на 7-й день культивирования составляет 40 мкг/мл, а в асцитной - 5-8 мг/мл. С помощью ИФА при использовании полученных МКА выявляют 30 пкг гормона/мл.