Способ генетической дактилоскопии Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике и судебной медицине,

Известны с/тедующие способы использования индивидуальных признаков человека: дактилоскопия, лабораторный анализ естественных выделений человека (слюны, пота, спермы и т.д.), определение группы крови и др. Однако перечисленными способами трудно определить происхождение тканей,и клеток, т.е. их принадлежность к определенному индивидуму или к рпределенному клону клеток человека, культивируемых In vitro.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения генотипэ по длине вариабельного тандемного повтора (ВТП), расположенного на 3 -м фланке протоонкогена HA-RAS 1 человека. Для этого геномную ДНК, гидролизованную ферм(внтом Msp I, гибридизуют в.жестких условиях с Р-ДНК-пробой, содержащей последовательности протоонкогена HA-RAS 1 человека (проба ДНК - EJ 6.6), иметодом авторадиографии выявляют специфические рестрикционные фрагменты ДНК. Так было установлено 32 аллельных варианта протоонкогена HA-RAS 1, которые присутствуют в геноме людей разных этнических групп. Аллели At, А2, A3 и А4 (часто встречающиеся) обнаружены у 91,3% обследованных людей; А1.2.А1.1.А4.1,А0.1,А1.3,А1.4 и А5 (средне встречающиеся) - у 5,6%; остальные (редкие: А3.2, А2.2. А2.3, А2.4, А3.1, АЗ.З. А3.4. А1.35, А2.01, А3.5, А4.2, А0.15. А0.2, А1.25. А2.015, А2.02, А2,025, А2.1, А2.11, А2.12, А5.2) только у 3,1% людей. Диплоидный геном человека содержит два аллеля протоонкогена HA-RAS 1, которые могут быть как равной длины (гомозиготный вариант), так и разной (гетерозиготный вариант). Таким образом, используя в качестве маркера длину ВТП HA-RAS 1, всех людей можно разделить на 32 группы, что равно 1024, Поскольку

аллели А1, А2. A3 и А4 встречаются чаще всего, то в популяции лк)дей превалирует только 16 (4) вариантов генотипа HA-RAS 1, остальные же - значительно реже. Причем, 61% людей содержит аллель А1, 12% - А2, 9,7 - A3 и 8,8%, - А4. Отсюда следует, что основной недостаток прототипа заключается в том, что он позволяет разделить всех людей только на отдельные группы, поскольку сам генетический признак носит популяционный характер.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа за счет использования маркеров, специфичных для каждого индивидума.

Способ заключается в том, что в качестве генетических маркеров предлагается использовать не только величийу ВТП, но и особенность распределения метильных групп на 5-м фланке протоонкогена HA-RAS 1. Для этого геномную ДНК гидролизуют ферментом Msp I, гибридизуют в мягких условиях с пробой EJ 6.6 (онкогеном HA-RAS 1) и выявляют рестрикционные фрагменты, принадлежащие 3 -му и 5 -му фланкам протоонкогена HA-RAS 1. На 5 -м фланке протоонкогена HA-RAS 1 имеется 32 участка, узнаваемых ферментом Msp I. Эндонуклеаза рестрикции Msp I узнает последовательность ЦЦГГ и не расщепляет ее, если наружный цитозин метилирован. Метилирование цитозиновых оснований (Ц) на 5 -м фланке протоонкогена HA-RAS 1 имеет признаки индивидуальной специфичности и не зависит от тканевой принадлежности клеток. Кроме того, метильные группы у наружного цитозина в последовательностях ЦЦГГ протоонкогена HA-RAS 1, которая сохраняется даже в ДНК злокачественных опухолей и их метастазов, присутствуютс высокой стабильностью. Достоверность результатов, полученных предлагаемым способом, достигается чрезвычайно низкой вероятностью выявления одинаковой рестрикционной картины в ДНК разных людей. Для 5 -го .фланк.а протоонкогена HA-RAS 1 число возможных вариантов равно (по ферменту Msp I) и 32 для З-го фланка HA-RAS 1 (по длине ВТП), т.е. всего 32 + 322 « ю . В этом уравнении второй показатель слева служит для сужения поиска до определенной группы лиц, а первый - для непосредственной идентификации объекта исследования по ийдивидуальному генетическому признаку. Величина и число дополнительных Msp I - рестрикционных фрагментов, не нарушается даже в ДНК злокачественных опухолей и их метастаз, что подтверждает стойкость выявленного генетического признака - ПДРФ 5-го фланка

протоонкогена HA-RAS 1, обусловленного индивидуальностью в распределении метильных групп у наружного цитозина в последовательностях ЦЦГГ геномной ДНК.

Пример. Использование протоонкогена HA-RAS 1 в изучении генотипа больных раком желудка.

Для этого выделяли геномную ДНК из карцинов и неизмененной слизистой оболочки желудка, а также лейкоцитов крови больных. Кусочки ткани (1г.) гомогенизируют в 10 мл TNE-буфера (10 мл трисНСЦ рН 8,0, 0,15 М NaCL, 1 мМ ЭДТА). Клетки гомогената лизируют прибавлением раствора

SDS до конечной концентрации 1% и подвергают фенольной экстракции в течение 10 мин при комнатной температуре при интенсивном перемешивании. Смесь центрифугируют при 2000д 10мин при4°С. Водную

фазу забирают и повторно экстрагируют фенолом в том же режиме до исчезновения интерфазы (3-4 раза). Затем к водной фазе прибавляют 2 объема этанола и получают осадок хромосомной ДНК. Хромосомную

ДНК обмывают 70%-ным этанолом и растворяют в дистиллированной воде. Концентрацию ДНК в растворе (мг/мл) определяют на спектрофотометре при длине волны 260 нм.

Венозную кровь (20-30 мл) больных насыщают гепарином (20 ед/мл), разбавляют 1/10 объема физиологическим раствором и центрифугируют при ЮООд 10 мин при 4°С. Плазму удаляют, а лейкоцитарную пленку

используют для выделения ДНК по описанной методике.

К 10мкгДНКприбавляют50едэндонуклеазы рестрикции Msp I и рестрикционный

буфер. Реакционную смесь инкубируют при

37°С в течение 10-16 ч при периодическом встряхивании пробирок. Для проверки качества используемого фермента параллельно с гидролизом основных препаратов ДНК ведут энзиматическую фрагментацию ДНК фагаЯв тех же условиях.

Гидролиз препаратов ДНК останавливают непосредственно перед электрофорезом, добавляя к ним 1/10 объема наслаивающего буфера, содержащего 70%

глицерина, 0,5% бромфенолового синего и 0,2 М ЭДТА, рН 8,0.

Электрофорез гидролизованных препаратов ДНК ведут в 1,5% геле агарозы, приготовленном на трис-ацетатном буфере (40

мМ трисНС, рН 8,0,20 мМ ацетата Na, 2 мМ ЭДТА). Продолжительность электрофореза составляет 10-12 ч при напряжении электриче.ского поля 2-3 В/см. Для определения размеров рестрикционных фрагментов основных, препаратов ДНК ведут параллельный электрофорез ДНК фага Я, гидролизованной ферментом NInd III или Pst I, После электрофореза гель агароЗы окрашивают в растворе этидия бромида (1 мг/мл), фотографируют в УФ-свете и обрабатывают 0,25 М НСГ в течение 10 мин. Затем гель помещают в прибор для переноса фрагментов ДНК на нейлоновые фильтры, Элюцию ДНК проводят в услов1лях 0,4 М NaOH 12-16 ч. споласкивают в 2-кратном SSC (1-кратный SSC содержит 0,15М NaCI, 0.015 М цитрата Na, рН7,0)и подсушивают на воздухе, Сухие фильтры можно хранить между листами фильтровальной бумаги неограниченное время. Для выявления Msp 1-рестрикционных фрагментов протоонкогена HA-RAS 1, нейлоновые фильтры, содержащие рестрицированную геномную ДНК, гибридизуют с пробой EJ 6,6, предварительно меченной радиоактивным фосфором ( ДЦТФ) в реакции ник-трансляции. Гибридизацию ведут 16-20 ч при 60-62°С в растворе следующего состава: 3-кратный SSC, 0,1% SDS, 0,5 мг/мл дрожжевой трНК и 5-кратный реагент Денхардта (50-кратный реагент Денхардта содержит фикол, поливинилпирролидон, бычий сывороточный альбумин по 5 гр на 500 мл НаО), Отмывку фильтров от непрогибридизовавшейся пробы ДНК осуществляют в трех режимах: сперва при комнатной температуре в четырех сменах раствора 2-кратного SSC и 0,1% SDS, затем при 37°С в течение 2 ч в четырех сменах того же раствора, после этого при 50°С в течение 2 ч в четырех сменах раствора 0,1-кратного SSC и 0,1 % SOS, Отмытые фильтры сушат в термостате при 37°С, Высушенные после гибридизации фильтры экспонируют на рентгеновской пленке в кассетах с усиливающими экранами в течение 3-10 сут. Продолжительность исследования составляет 15 дней. Как видно из примера использование предлагаемого способа изучения генотипа людей на основании особенностей структуры 3 и 5 фланков протоонкогена HA-RAS 1 позволило разбить обследованных больных на 4 группы и выявить генетические признаки, присущие каждому индивидуму в отдельности. Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет на генетическом уровне установить принадлежность ткани (клеток) определенному человеку; определить происхождение кусочков тканей или клеток, принадлежат они одному лмцу или разным; проверить клональность популяции клеток в культуре и степень их.загрязнения клетками иного происхождения в ходе научных работ. Формула изобретения Способ генетической дактилоскопии, включающий определение генотипа по длине вариабельного тандемного повтора, расположенного на з-м фланке протоонкогена HA-RAS 1 человека, о т л и.ч а ющ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа за счет использования маркеров, специфичных для каждого индивидуума, определяют распределение метильных групп на 5-м фланке протоонкогена HA-RAS 1,

, Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике и судебной медицине. Целью изобретения является повышение чувствительности способа за счет использования маркеров, специфичных для каждого индивидуума в отдельности. В качестве генетических маркеров предлагается использовать не только величину ВТП, но и особенность распределения метильных групп на 5' -м фланке протоонко- гена HA-RAS 1 в геноме людей.