Питательная среда для культивирования инфузорий ТетRанYмеNа рYRIFоRмIS Советский патент 1992 года по МПК A01K61/00 C12N1/10 C12N1/10 C12R1/90 

Изобретение относится к прикладной биологии и может быть использовано при культивировании инфузорий Tetrahymena pyrifprmls преимущественно при использовании их в качестве тест-объекта в токсило- тических исследованиях.

При проведений исследований с использованием инфузорий Tetrahymena pyrlformls целесообразно использовать две различные питательные среды: для сохранения основной культуры и для выращивания рабочей культуры. Питательную среду для сохранения основной культуры готовят на основе печени или бульонов и применяют для длительного хранения культуры без пересевов (до 3 мес). На этой среде культура развивается медленнее, с меньшим делением клеток и благодаря длительным интервалам между пересевами сохраняется с меньшим риском загрязнения. Питательная среда для выращивания рабочей культуры,

которую используют непосредственно при проведении исследований, напримертокси- логических, должна обеспечивать интенсивный прирост биомассы и стабильность рН при внесении в нее исследуемых химических веществ, быть простой в приготовлении и доступной по составу компонентов.

Известна глкжозная среда для культивирования инфузорий Tetrahymena pyrlformls, содержащая 0,10 г дрожжевого экстракта, 1,5 г глюкозы и 0,10 г хлорида натрия на 100 мл воды.

Недостатками данной среды являются колебания рН в процессе роста инфузорий и при внесении в нее исследуемых химических веществ, содержание в ней дефицитного и дорогостоящего препарата - дрожжевого экстракта, а также обедненный состав по количеству факторов роста, что не позволяет обеспечить интенсивный прирост биомассы.

Известна также аминопептидная среда, которая на 100 мл содержит 13 мл амино- пептида,0,2 г дрожжевого экстракта и биди- стилированную воду.

Недостатками аминопептидной среды являются включение в ее состав дефицитных и дорогостоящих препаратов-дрожжевого экстракта и аминопептида, а также нестабильность рН.

Наиболее близкой к предлагаемой является пептонная среда, содержащая на 100 мл среды 2 г пептона, 0,5 г глюкозы, 0,1 г дрожжевого экстракта, 0,1 г хлорида натрия и воду.

Недостаток известной среды обусловлен значительным колебанием рН среды при внесении в нее исследуемых химических веществ. Все культуры, и в частности Tetrahymena pyrldormls, во время роста проявляют тенденцию к изменению рН среды. Если основной частью питательной среды является пептон, то в результате дезамини- рования аминокислот образуется щелочь и рН среды увеличивается. При внесении в культуру химических веществ с различным рН с целю определения их токсического воздействия на инфузории, нестабильность величины рН питательной среды ведет к существенным погрешностям в результатах определений. Кроме того, глюкозо-пептон- ная среда содержит дефицитный и дорогостоящий препарат - дрожжевой экстракт.

Цель изобретения - стабилизация рН среды и ее удешевление.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для культивирования инфузорий Tetrahymena pyriformis содержит глюкозу, хлорид натрия, дистиллированную воду, дрожжевой автолизат, фосфатный буфер и сульфат магния в указанных соотношениях.

Фосфаты поддерживают рН среды, кро- . метого, клетка инфузории использует их как источник фосфора и калия. Неорганические фосфаты служат для обеспечения роста микроорганизмов и играют большую роль в клеточном метаболизме. Ионы калия выполняют функцию каферментов и принимают участие в формировании структуры РНК в клетке. Шгний является элементом минерального питания. Функцией ионов магния в метаболизме клеток инфузорий является, в основном, активация различных ферментов, помимо этого, ионы магния играют важную роль в регуляции степени агрегации рибосомных частиц. Ионы магния также необходимы для под держания осмотического давления, элект- розаряженности и регулирования рН. Сера, входящая в состав сульфата магния, служит

источником энергии, потребление ее идет на синтез аминокислот. Таким образом, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат калия и сульфат магния, кроме поддержания рН

среды, принимают активное участие в росте клетки инфузорий и придают питательной среде новые свойства. Замена пептона и дрожжевого экстракта на дрожжевой автолизат в качестве добавки природного проис0 хождения позволяет увеличить выход биомассы по сравнению с известной питательной средой, уменьшить себестоимость наращивания биомассы и обеспечить доступной питательной среды по составу ком5 понентов, так как дрожжевой автолизат получают из обычных пекарских дрожжей.

Для экспериментальной проверки предлагаемого состава были подготовлены 17 смесей компонентов, на основании кото0 рых был выбран оптимальный состав питательной среды (табл. 1). Смеси получали простым смешением фосфатного буфера, глюкозы, хлорида натрия и дистиллированной воды,автоклавированием их в течение

5 30 мин при 0,5 атм и добавлением непосредственно перед употреблением стерильного 20%-ного раствора сульфата магния и стерильного дрожжевого автолизата. Дрожжевой автолизат получали из пекарских

0 дрожжей следующим образом: к 13,5 г пекарских дрожжей добавляли 50 мл дистиллированной воды и кипятили в течение 30 мин, после чего полученную смесь охлаждали и оставляли при +4°С на 4-6 сут, затем

5 при помощи центрифуги при 3000 об/мин в течение 30 мин отделяли осадок и н адоса- дочную жидкость стерилизовали автоклавированием при 0,5 атм в течение 30 мин. В качестве контроля использовали ами0 нопептидную среду, в которой, как следует из табл. 1, происходит более интенсивный прирост биомассы инфузорий Tetrhymena pyriformis по сравнению с другими известными средами. Из табл. 1 следует, что мак5 симальный выход биомассы наблюдается при внесении в питательную среду (на 100 мл) 20,00-25,00 мл дрожжевого автолизата и 0,04-0,05 г сульфата магния. Фосфатный буфер типа Зеренсена взят в соотношении,

0 необходимом для получения среды с рН 7,1.

В табл. 2 представлены данные по себестоимости наращивания биомассы инфузорий Tetrahymena pyrlfornis в известных и,

5 предлагаемой питательных средах. Предлагаемая питательная среда позволяет снизить себестоимость наращивания биомассы в 15,8 раз по сравнению с аминопептидной, а 2,8 раза по сравнению с глюкозной и в 5,8 раз по сравнению с пептонной средами.

Изобретение обеспечивает стабилизацию рН среды в процессе роста инфузорий и внесении в культуру исследуемых веществ и удешевление среды исходя из себестоимости наращивания биомассы за счет использования доступных и дешевых компонентов и повышения интенсивности роста культуры.

Формула изо бретени я Питательная среда для культивирования инфузорий Tetrahymena pyrlformls, содержащая глюкозу, хлорид натрия, добавки

природного происхождения и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что,

0

с целью стабилизации рН среды и ее удешевления, она содержит дополнительно фосфатный буфер - гидрофосфат натрия и дигидрофосфат калия и сульфат магния, а в качестве добавки природного происхождения используют дрожжевой автолизат при следующем соотношении компонентов (на 100 мл среды), г:

Гидрофосфат натрия 0,35-0,36 Дигидрофосфат калия 0.18-0,19 Сульфат магния0.04-0,05

Глюкоза1,00-1,05

Хлорид натрия0,1-0-6,11

Дрожжевой автолизат 20,00-25,00 Дистиллированная вода Остальное

Таблица I

Изобретение относится к гидробиологии - водной токсикологии, и может быть использовано при культивировании инфузорий Tetrahymena pyriformls. Целью изобретения является стабилизация рН среды и ее удешевление. Питательная среда содержит глюкозу, хлорид натрия, фосфатный буфер, сульфат магния, дрожжевой автолизат и дистиллированную воду. 2 табл.

Таблица 2