ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛЕЙШМАНИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/10 C12Q1/04 

Изобретение относится к биотехнологии и касается рецептуры питательной среды для культивирования промастигот лейшманий при их вторичной идентификации.

Наиболее употребительной средой для культивирования лейшманий является MN-агар, включающий среду 199, гидролизат лактальбумина, агар-агар и дефибринированную кроличью кровь (David A.Evans. Leishmania, London, 1985; Юсупов К. А. Щеткин В.Ю. Выращивание биомассы промастигот лейшманий. - "Медицинская паразитология и паразитарные болезни", 1978, 2, 86-92).

Однако данная среда дорогая из-за наличия вышеуказанных дефицитных компонентов.

Известно также, что для культивирования лейшманий используется среда Романова (Грачева Л.И. Засухин Д.Н. Романов Г.В. Применение новых сред для культивирования лейшманий. -"Лабораторное дело", 1961, 6, 46-48), включающая D-казеиновый гидролизат, печеночный отвар, экстракт гематина, глюкозу, тиамин, сульфат магния, хлориды кальция и калия, фосфаты натрия и калия, никотиновую кислоту и воду (Романов Г.В. Однофазная казеиново-дрожжевая среда для культивирования трипаносомы Круци. -"Лабораторное дело", 1961, 7, 54-55).

Эта среда также дорогая из-за дефицитности пищевых компонентов (печеночного отвара) и сложной технологии получения экстракта гематина из кровяных зерен и получения дрожжевого казеинового гидролизата длительной ферментативной обработкой.

Наиболее близкой к заявляемой является среда Шандури, включающая пептон, солодовый экстракт, хлористый натрий, гемин и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:
Пептон 10
Солодовый экстракт 5
Хлористый натрий 4
Гемин 0,0006
Дистиллированная вода Остальное
В данной среде использую только депротеинизированный солодовый экстракт, а гемин вносят непосредственно перед посевом исследуемой культуры (G. Chaudhuri et al. A new medium for large scale production of Leishmania donovani promastigotes for biochemical studies. Indian J Med Res 1984, nov. 1986, pp. 457-460).

Внесение гемина заблаговременно при приготовлении прототипной среды приводит к потере ее ростовых свойств. Внесение же гемина непосредственно перед использованием среды неудобно, в частности из-за необходимости сохранения стерильности. Кроме того, прототипная среда сложна в изготовлении, поскольку солодовый экстракт необходимо предварительно депротеинезировать.

Целью изобретения является упрощение среды и повышение ее стабильности.

Указанная цель достигается тем, что питательная среда для культивирования лейшманий, включающая пептон, гемин и дистиллированную воду, дополнительно содержит экстракт кормовых дрожжей (ЭКД), мальтозу, фолиевую кислоту, магний сернокислый семиводный, кальций хлористый двуводный, калий хлористый, дигидрофосфат натрия и калий фосфорнокислый двузамещенный при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Пептон 10±2
Гемин 0,0006±0,0002
ЭКД 6,5±3,5
Мальтоза 0,75±0,25
Фолиевая кислота 0,7±0,3
Магний сернокислый семиводный 0,2±0,1
Кальций хлористый двуводный 0,15±0,05
Калий хлористый 0,2±0,1
Дигидрофосфат натрия 11,0±0,5
Калий фосфорнокислый двузамещенный 1,7±0,3
Дистиллированная вода Остальное
Среду готовят смешением указанных сухих ингредиентов в шаровой мельнице с последующим растворением в дистиллированной воде, кипячением, фильтрованием через ватно-марлевый фильтр, розливом и автоклавированием при 112^oC в течение 0,5 ч.

Пример 1. Предлагаемую питательную среду готовят при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Пептон 10
Гемин 0,0006
ЭКД 6,5
Мальтоза 0,75
Фолиевая кислота 0,7
Магний сернокислый семиводный 0,2
Кальций хлористый двуводный 0,15
Калий хлористый 0,2
Дигидрофосфат натрия 11
Калий фосфорнокислый двузамещенный 1,7
Дистиллированная вода Остальное
Среду готовят как описано, при этом pH среды 7,3 устанавливают с помощью 0,01 М бикарбоната натрия и обеспечивается за счет буферности системы.

Параллельно готовят две контрольные среды, включающие пептон, солодовый экстракт, хлористый натрий, гемин и дистиллированную воду при соотношении указанных ингредиентов.

1. Контроль N 1. Смешивают солодовый экстракт, пептон и хлористый натрий в массовом соотношении 5:10:4 соответственно и растворяют в 0,1 окончательного объема дистиллированной воды, устанавливают pH 7,4 с помощью 0,1 М раствора бикарбоната натрия, кипятят в водяной бане в течение 15 мин, охлаждают, центрифугируют, отделяют коагулянт протеина, добавляют 0,9 окончательного объема дистиллированной воды и стерилизуют автоклавированием при 112^oC в течение 0,5 ч. Непосредственно перед использованием в раствор с соблюдением правил асептики вносят 600 мкг/л гемина, как это указано в описании прототипа.

2. Контроль N 2. Среду готовят как в контроле N 1, но гемин вносят перед операцией кипячения.

В предлагаемую и контрольную среды (по 6 пробирок) засевают по 0,2 тыс. особей следующих культур лейшманий: L major NeaeP, L. turanica КД-51, L. gerbillii-GO и L. donovani ДД-8.

Пробирки инкубируют при 23^oC в течение 14 дней. Содержание промостигот в выросших культурах количественно учитывают с помощью камеры Горяева.

Результаты культивирования приведены в табл.1.

Как видно из табл.1, рост промастигот лейшманий на предлагаемой среде несколько выше чем на прототипной, технология получения которой строго соответствует описанию прототипа (контроль N 1). Однако это увеличение выхода статистически незначимо при p=0,05. Возможно, что статистическая незначимость увеличения роста в данном примере имеет место из-за малого объема выборки. В то же время при получении прототипной прописи способом, адекватным получению предлагаемой среды (контроль N 2), т.е. при внесении гемина перед операцией кипячения, контрольная среда не обеспечивает роста промастигот лейшманий (наблюдаются лишь единичные клетки), что, как мы предполагаем, объясняется разрушением гемина в составе данной прописи при ее термообработке. В предлагаемой рецептуре гемин, по-видимому, защищен дополнительно внесенными ингредиентами.

Пример 2. Питательную среду готовят как в примере 1 при соотношениях ингредиентов, указанных в табл.2.

В каждый вариант среды засевают по 0,2 тыс. особей культур лейшманий, указанный в примере 1, а также L.infantum Lem 78 (по 6 пробирок на каждый вариант среды для каждой культуры). Культивирование проводят как в примере 1. Результаты культивирования приведены в табл.3.

Как видно из табл.3, промастиготы лейшманий хорошо растут при заявленном соотношении ингредиентов рецептуры среды (среда N 2 минимальные концентрации ингредиентов, среда N 3 среднее значение, среда N 4- максимальные концентрации ингредиентов) и плохо растут при запредельных значениях концентраций ингредиентов (среды NN 1 и 5).

Использование предлагаемой среды позволяет:
упростить состав среды и технологию ее получения, так как из прописи исключен солодовый экстракт, использование которого требовало его предварительного депротеинизирования, а введенные минеральные добавки, очевидно, дешевле депротеинизированного солодового экстракта;
повысить стабильность среды, поскольку, как проиллюстрировано в примере 1, она сохраняет питательные свойства при термообработке в присутствии гемина, тогда как полная пропись прототипной среды реализуется лишь непосредственно перед посевом лейшманий.

Использование: питательная среда, культивирование лейшманий, биотехнология. Сущность изобретения: питательная среда включает пептон, гемин, экстракт кормовых дрожжей, мальтозу, фолиевую кислоту, магний сернокислый семиводный, кальций хлористый двуводный, калий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный и дистиллированную воду. Среда проста в изготовлении, стабильна и сохраняет питательные свойства при термообработке в присутствии гемина. 3 табл.

Питательная среда для культивирования лейшманий, включающая пептон, гемин и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит экстракт кормовых дрожжей, мальтозу, фолиевую кислоту, магний серно-кислый семиводный, кальций хлористый двуводный, калий хлористый, натрий фосфорно-кислый двузамещенный, калий фосфорно-кислый двузамещенный при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Пептон 8-12
Гемин 0,0004-0,0008
Экстракт кормовых дрожжей 3-10
Мальтоза 0,5-1,0
Фолиевая кислота 0,4-1,0
Магний серно-кислый семиводный 0,1-0,3
Кальций хлористый двуводный 0,1-0,2
Калий хлористый 0,1-0,3
Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 10,5-11,5
Калий фосфорно-кислый двузамещенный 1,4-2,0
Дистиллированная вода До 1 лт