Способ восстановления вирулентности чумного микроба Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам повышения вирулентности штаммов чумного микроба.

При проведении экспериментальных работ в научно-исследовательских лабораториях противочумных учреждений требует- - ся высоковирулентнзя субкультура вирулентного штамма чумного микроба. Известно, что при длительном хранении в лабораториях и при пересевах на искусственных питательных средах чумной микроб снижает свою вирулентность. Такие субкультуры не пригодны для работы.

Известен способ повышения, вирулентности субкультур вирулентных штаммор чумного микроба путем многократного пассирования через организм экспериментальных животных. По известному способу двух- суточную культуру чумного микроба, выращенную при 28°С на агаре Хоттингера, вводят подкожно экспериментальным животным, которых на 4-5-е сутки забивают, делают высевы из регионарного лимфатического узла, печени,селезенки на соответствующие питательные среды и полученной субкультурой вновь заражают животных.

Однако по известному способу каждый пассаж занимает 5-7 сут. Кроме того, частота получения субкультуры следующего пассажа зависит от индивидуальных особенностей животных.

Цель изобретения - ускорение способа.

XI

а

4 о со о

Пример. Перитонеальные макрофаги получают промыванием брюшной полости морских свинок 20 мл среды 199 с гепарином (5 ед/мл), содержащей 10% сыворотки крови человека, инактивированной при 56°С в течение 30 мин. Определяют концентрацию макрофагов путем подсчета в камере Горяева и добавляют взвесь субкультуры вирулентного штамма, выращенного в течение суток при 28°С на агаре Хоттингера (рН 7,2), таким образом, чтобы соотношение количества макрофагов и числа микробов составляло 1:10.

Приготовленную взвесь макрофагов с бактериями разливают по 1 мл в стерильные пенициллиновые флаконы (по 3-4 флакона на одну субкультуру), которые закрывают стерильными резиновыми пробками и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Прикрепившийся слой клеток промывают средой 199 для удаления неприкрепившихся клеток и .внеклеточно расположенных микробов и заливают 2 мл среды 199, содержащей 20% инактивированной сыворотки крови человека. Среду заменяют свежей через б ч культивирования при 37°С и продолжают инкуоировать при этой температуре еще 18 ч, после чего среду культивирования сливают и к оставшемуся на стенке флакона слою макрофагов добавляют 0,2 мл дистиллированной воды, осторожно снимают пипеткой монослой макрофагов и флаконы встряхивают. Макрофаги при этом разрушаются и расположенные внутри них микроорганизмы высвобождаются. Полученной взвесью микробов, собранных из 3-4 флаконов (первый пассаж субкультуры), инфицируют свежие макрофаги для получения следующего пассажа. Проведено 3 пассажа.

Вирулентность исследуемых штаммов определют по общепринятому методу титрования на животных и выражают величиной ЛД50. Полученные данные приведены в табл. 1, из которой видно,-что 3-кратное пассирование terslnia pestis 1204 существенно повышает его вирулентность (в 170 раз).

П р и м е р 2. Проводят аналогично примеру 1, но содержание сыворотки в среде 15%. Проведено 2 пассажа, так как ЛДзо исходной субкультуры значительно ниже,

чем в примере 1. Полученные данные представлены в табл.2.

Из табл. 2 видно, что двукратное пассирование предлагаемым способом субкультуры I. pestis 773 существенно повышает ее

вирулентность (в 7 раз).

ПримерЗ. Проводят аналогично примеру 1, но содержание сыворотки в среде 20%. Проведен 1 пассаж, так как ЛДбо исходной субкультуры ниже, чем в

примере 2. Полученные данные представлены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что однократного пассирования предлагаемым способом субкультуры I. pestis 1300 достаточно, чтобы

повысить ее вирулентность до максимальной величины.

Преимуществами способа являются его ускорение в 5-7 раз по сравнению с общепринятым способом (1 и 5-7 дней соответственно) и экономия животных, так как экссудата от одной морской свинки достаточно для одновременного пассирования 5 субкультур, Кроме того, частота получения субкультуры следующего пассажа не зависит от индивидуальных особенностей животного.

Формула изобретения

Способ восстановления вирулентности чумного микроба, включающий инкубирование культуры в чувствительной биосйстеме с последующим выделением микроба, о т- л имеющийся тем, что, с целью ускорения

способа, в качестве чувствительной биосистемы используют макрофаги морских свинок, заражают их культурой в соотношении 1:10 и инкубируют в течение суток в среде 199, содержащей 10-20% инактивированной сыворотки крови человека, а выделяют микробы путем разрушения монослоя макрофагов дистиллированной водой.

Таблица 1

Таблица 2

Изобретение относится к- медицинской микробиологии, в частности к способам повышения вирулентности штаммов чумного микроба. Цель изобретения - ускорение способа. К перитонеальным макрофагам морских свинок добавляют культуру вирулентного штамма чумного микроба в соотношении 1:10. Полученную суспензию культивируют в среде 199, содержащей 10- 20%, инактивированной сыворотки крови человека, в течение 24 ч при 37°С, после чего макрофаги разрушают дистиллированной водой, а освободившимися из них микробными клетками инфицируют свежую культуру макрофагов. Способ может быть использован для повышения вирулентности субкультур вирулентных штаммов чумного микроба, снизивших ее в процессе хранения. 3 табл. сл с

Таблица 3