Способ повышения иммуногенности вакцинных штаммов чумного микроба Советский патент 1987 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии.

Целью изобретения является ускорение способа за счет исключения использования живого организма.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Перитонеальные макрофаги получают промьюанием брюшной полости морских свинок 20 мл среды 199 с гепарином (5 ед/мл), содержащей 20% сьгеоротки крови человека, инактивированной при в течение 30 мин. Определяют концентрацию макрофагов путемподсчета в камере Горяева и добавляют взвесь субкульт фы Y, pestis EV, выращенной в течение 1 сут. при на агаре Хоттингера (рН 7,2) таким образом, что соотношение количества макрофагов и числа микробов составляет 1:50,

Приготовленную взвесь макрофагов с бактериями разливают по 1 мл в стерильные пеницшшиновые флаконы tno 3-4 флакона на одну субкультуру) , которые закрывают стерильными резиновыми пробками и инкубируют при ЗУС в течение 1 ч. За это время макрофаги прикрепляются к стеклу, после чего флаконы вынимают из термостата. Прикрепившийся слой клеток про14ывают средой 199 для удаления

Двусуточную культуру, выращенную при на агаре Хоттингера (рН-7,2), вводят подкожно в дозе 5 ЧО микробных клеток 2-3 морским свинкам. Так как животные от указанных доз не погибают, их забивают на 5-7-е сутки, делают высевы из места введения культуры, лимфатического узла, печени, селезенки на соответствующие питатеJO льные среды и полученной субкультурой вновь заражают животных. Всего проводят 20 пассажей.

Иммуногенность исходных и пассированных субкультур определяют на бе15 лых мьтах массой 18-20 г по критерию ImD - количеству микробных клеток, способных предохранить через 21 сут 50% взятых в опыт живот- , ных от 200 DC1 вирулентного штамма

20 |Чумного микроба. В качестве вирулент- його штамма используют Y. pestis 361(1)-1479, 1 DCl которого составляет 25 микробных клеток. Полученные результаты приведены в табл. 1, из

25 которой ввдно,.что используя предлагаемый способ, можно значительно повысить Иммуногенность вакцинного штамма чумного микроба и в более короткий срок, чем при пассивирова30 НИИ обычным способом. Так, IraD субкультуры 10 пассажа на макрофагах соответствует ImD субкультуры 20

пассажа на морских свинках и в 25 раз превосходит ImDj исходной неприкрепившихся клеток и внеклеточ- 5 субкультуры. Дальнейшее пассиррва-, но расположенных микробов и заливают ние на макрофагах еще больше по- 2 мл среды 199, содерж щей 20% инак- вышает Иммуногенность субкультур, тивированной сыворотки крови чело- Так, ImDj субкультуры 20 пассажа века. Среду заменяют свежей через на макрофагах в 70 раз превосходит 6-8 ч культивирования при и про-4о IniDj исходной субкультуры и значи- должают инкубировать при этой тем- тельно вьш1е ImDj субкультуры, пасси пературе еще 13-15 ч (всего 20-24 ч), рованной 20 раз на морских свинках, после чего среду культивирования Данные по количеству жизнеспособ- сливают и к оставшемуся на стенке ных микробов при использовании мак- флакона слою макрофагов добавляют 45 рофагов приведены в табл. 2. 0,2 мл дистиллированной воды, осто- Способ позволяет быстро повысить рожно снимают пипеткой монослой мак- Иммуногенность субкультур вакционно- рофагов и флакон встряхив.ают. Макро- го штамма чумного микроба. Для полуфаги при зтом разрушаются, и располо- одной и той же величины имму- женные внутри них микроорганизмы выс-зо ногенности предлагаемым способом вобождаются. Полученной взвесью i (in vitro) требуется 10 пассажей,

а обычным (in vivo) - 20. Если учесть, что каждый пассаж in vitro занимает 1 сут, а in vivo - 10 сут, 55 то один и тот же иммуногенный эффект

микробов, собранных из 3-4 флаконов (первый пассаж субкультуры), инфицируют свежие макрофаги для получения следующего пассажа. Всего проводят 20 пассажей.

Параллельно проводят пассирование этой же субкультуры Y. pestis EV на морских свинках массой 250-300 г.

достигается способом по изобретению в 20 раз быстрее, чем известным способом (10 дней вместо 200 дней соответственно) .

Двусуточную культуру, выращенную при на агаре Хоттингера (рН-7,2), вводят подкожно в дозе 5 ЧО микробных клеток 2-3 морским свинкам. Так как животные от указанных доз не погибают, их забивают на 5-7-е сутки, делают высевы из места введения культуры, лимфатического узла, печени, селезенки на соответствующие питательные среды и полученной субкультурой вновь заражают животных. Всего проводят 20 пассажей.

Иммуногенность исходных и пассированных субкультур определяют на белых мьтах массой 18-20 г по критерию ImD - количеству микробных клеток, способных предохранить через 21 сут 50% взятых в опыт живот- ных от 200 DC1 вирулентного штамма

|Чумного микроба. В качестве вирулент- його штамма используют Y. pestis 361(1)-1479, 1 DCl которого составляет 25 микробных клеток. Полученные результаты приведены в табл. 1, из

которой ввдно,.что используя предлагаемый способ, можно значительно повысить Иммуногенность вакцинного штамма чумного микроба и в более короткий срок, чем при пассивироваНИИ обычным способом. Так, IraD субкультуры 10 пассажа на макрофагах соответствует ImD субкультуры 20

достигается способом по изобретению в 20 раз быстрее, чем известным способом (10 дней вместо 200 дней соответственно) .

312499394

Таблица

Данные по иммуногенности вакцинного штамма чумного микроба

Таблица 2

Количество жизнеспособных чумных бактерий в монослое макрофагов в зависимости от микробной нагрузки

1:10

1:25

210 (1-5-10)

1:50 (2,5-6-10)

Отсутствие микробов внутри макрофагов

10-15% макрофагов содержат чумные бактерии (1-2 м.кл.)

80-90% макрофагов содержат микроколонии чумного микроба (50-90 м.кл.)

1:100

1,5.10 (5-10-4.10)

1:200

Количество микробов определяют высевом ряда десятикратных

разведений на агар Хоттингера (рН 7,2). Учет осуществляют через 48 ч инкубации при ,

Редактор Е. Корина

Составитель В. Дроздов Техред Н.Глущеико

Заказ 804/2Тираж 500Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие,/г. Ужгород, ул. Проектная, 4

12А9939

6 Продолжение табл. 2

Редкий слой макрофагов; оставшиеся на стекле макрофаги разрушены, внеклеточно расположенные микробы

На стекле единичные разрушенные макрофаги, клеточный детрит

Корректор Л.Патай