Способ получения мутантов чумного микроба Советский патент 1993 года по МПК C12N15/01 

Изобретение относится к микробиологии, генетике бактерий, в частности, к способу моделирования мутационной изменчивости возбудителя чумы.

Целью изобретения является усиление интенсивности и специфичности мутагенного действия фагоцитов, и увеличение разнообразия типов получаемых мутантов.

Это достигается тем, что живым грызунам в брюшную полость вводится суспензия бактерий. Смыв бактерий из брюшной полости производится после забивки животных через различные промежутки времени. Из экссудата бактерии высеваются на твердые питательные среды с последующим отбором мутантов.

Известные способы, в которых используется мутагенное действие ПМД на бактерии в опытах In vitro с выделением из крови людей или из брюшной полости экспериментальных животных градиентным центрифугированием чистых пулов ПМЛ. производились в искусственной среде с участием лишь одного из компонентов фагоцитарной системы. Частота мутационных событий при моделировании изменчивости чумного микроба в опытах In vitro (от 2,8 х хЮ до 1 10 оказалась ниже, чем при использовании заявляемого способа (от 4 10 до t ), чему способствовали более комфортные условия фагоцитирования в организме грызуна.

Таким образом, сопоставительный анализ показывает, что заявляемый способ совпадает с прототипом по одному компоненту (применяется мутагенная активность ПМЛ

00

GJ

Ј Ю О

00

на бактерии) и отличается следующими положениями: чумной микроб вводится непосредственно в брюшную полость живых грызунов с последующим смывом бактерий после забивки животных.

Предлагаемый способ получения мутантов может быть реализован на модели любого экспериментального животного с использованием различных видов бактерий.

Пример 1. Способ получения ауксот- рофных мутантов чумного микроба из штамма А-1724 при интраперитонеальном действии фагоцитов белых крыс.

Из двухсуточной агаровой культуры штамма чумного микроба А-1724 (выделен в Гиссарском природном очаге), растущего при 28°С на минимальной среде (МС), содержащей глюкозу, сульфит натрия, цисте- ин, метионин, фенилаланин, лейцин и аргинин, готовят суспензию по стандарту мутности (10 единиц) в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2) с концентрацией микробных клеток (м.к.) 1 10 в 1 мл. Последовательным разведением пипеткой переносят 0,5 мл суспензии в пробирки с 4,5 мл физиологического раствора (ФР) до концентрации 1 10 м.к./мл.

Белой крысе интраперитонеально шприцем вводят 5 мл 0,1 % стерильного раствора глюкогена. Через 6 час белой крысе вводят интраперитонеально 1 мл суспензии с концентрацией 1 10 м.к./мл.

Через один час усыпляют животное парами хлороформа, металлическими прико- лышами фиксируют на вскрывочной доске, продольным разрезом ножницами рассекают кожу по средней линии живота .(все ма- нипуляции проводят стерильным инструментом) и короткими поперечными (по 2 см) - к каждой лапке, придерживая свободный край кожи хирургическим пинцетом, отсепаровывают кожу, освобождая брюшную стенку. Брюшную стенку протирают спиртовым тампоном и внутрибрю- шин но вводят шприцем 10 мл физиологического раствора с 0,25% этиле- наминотетраацетатом (ЭДИА). Захватив пинцетом складку брюшной стенки, слегка покачивая животное, распределяют введенный раствор. Придерживая пинцетом складку брюшной стенки, ножницами делают продольный разрез (2 см), в брюшную полость вводят стерильный марлевый тампон (1 см на 1 см) и под защитой тампона длинной иглой (более 5 см) со сточенным концом набирают в шприц экссудат, и переносят его в центрифужную пробирку.

Экссудат центрифугируют 10 мин при 4000 оборотах/мин. Супернатант отсасывают пипеткой, а к осадку прибавляют 2 мл физиологического раствора. Последовательным разведением пипеткой переносят 0,2 мл суспензии в пробирки с 1,8 мл ФР (до

четвертого разведения) и из каждого разве- дения производят высев по 0,1 мл ни пластинки агара Хоттингера. Чашки инкубируют при 28°С, а разведения хранят при4°С.

Учет выросших колоний производят через 24 часа и из разведения с оптимальной концентрацией микроорганизмов (рост 60- 80 колоний) производят высев пипеткой по 0,1 мл на пластинки агара Хоттингера.

Через 24-48 часов инкубации при 28°С производят отпечатки колоний с чашки бархоткой, закрепленной на текстолитовой круглой пластинке меньшего, чем дно чашки Петри диаметра, методом реплик по Д.

Ледерберг, Е.Ледерберг (1952) на пластинки МС.

На 2-3 сутки инкубации при сличении чашек с агаром Хоттингера и МС, отбирают варианты, которые растут на полной среде

и не растут на минимальной. Такие субкультуры высевают на селективные питательные среды, содержащие компоненты МС с добавлением дополнительных факторов роста (табл.1).

Таким образом, результаты опыта позволяют сделать вывод о получении ауксот- рофных мутантов чумного микроба.

Частота мутаций на количество высеянных клеток для никотинамидзависимых ауксотрофов составила - 4 , для триптофанзависимого - 1,2 .

Таким же способом, наряду с другими ауксотрофами, получен и цитидинзависи- мый мутант чумного микроба.

П р и м е р 2. Способ получения различающихся по вирулентности мутантов чумного микроба из штамма № 224 при интраперитонеальном действии фагоцитов

белых крыс. .

Из двухсуточной агаровой культуры чумного микроба № 224 (выделен в Устюртском природном очаге, вирулентен для морских свинок (LDso 177 м.к.) готовят суспензию по

стандарту мутности (10 единиц) в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2) с концентрацией микробных клеток 1 10 в 1 мл. Последовательным разведением пипеткой переносят 0.5 мл суспензии в пробирки с 4,5 ФР до концентрации 1 107 м.к./мл.

Белой крысе интраперитонеально шприцем вводится 5,0 мл 0,1 % стерильного раствора гликогена. Через б часов вводят

интраперитонеально 2,0 мл суспензии бактерий в концентрации 1.107 м.к./мл.

Через три часа усыпляют животное парами хлороформа,металлическими прико- лышами фиксируют на вскрывочной доске, продольным разрезом рассекают кожу по средней линии живота (все манипуляции проводят стерильными инструментами) и короткими поперечными (пор 2 см)- к каждой лапке, придерживая свободный край кожи хирургическим пинцетом, отсепаро- вывают кожу, освобождая брюшную стенку. Брюшную стенку протирают спиртовым тампоне и внутрибрюшинно вводят 10,0 мл ФР с 0,25% ЭДТА. Захватив пинцетом складку брюшной стенки, слегка покачивая животное, распределяют введенный раствор. Придерживая пинцетом складку брюшной стенки, ножницами делают продольный разрез (около 2 см), в брюшную полость вводится стерильный марлевый тампон (1 см на 1 см) и под защитой тампона, длинной иглой (более 5 см) со сточенным концом набирают в шприц экссудат и переносят его в центрифужную пробирку,

Экссудат центрифугируют 10 мин при 4000 оборотах в минуту. Супернатант отсасывают пипеткой, а к осадку прибавляют 2 мл ФР. Последовательным разведением пипеткой переносят 0,2 мп суспензии в про- бирки с 108 мл ФР (до четвертой пробирки) и из каждого разведения производят высев по 0,1 мл на пластинки агара Хоттингера. Чашки инкубируют при 28°С, а разведения хранят при 4°С.

Учет выросших колоний производят через 24 часа и из разведения с оптимальной концентрацией бактерий (рост 60-80 колоний) производят высев пипеткой по 0,1 мл на пластинки агара Хоттингера.

Через 48 часов инкубации проводят ориентировочное определение вирулентности полученных субкультур на морских свинцах. Для этого из каждой субкультуры готовят суспензию (как описано выше), по- следовательно разводят ее до концентрации 1 10 м.к./мл и 1,0мл этого разведения

бактерий вводят подкожно трем морским свинкам в область верхней треги бедра.

Учет результатов в течение 10 суток (острый инфекционный процесс). При наличии субкультур, не приведших к гибели животных в указанные сроки, проводят аналогичную описанной титрацию таких субкультур и заражают подкожно на каждую дозу по 4 морских свинок по 1,0 мл из разведений 1 104, 1 105, 1 106, 1 107. 1 108 м.к./мл. Сравнение вирулентности полученных мутантов проводят через 10 суток по количеству погибших животных с бактериологическим подтверждением инфекционного процесса (табл.2).

Таким образом, результаты позволяют сделать выводе получении мутантов чумного микроба с различной вирулентностью.

Технико-экономическое значение заявляемого способа заключается в том, что частота мутаций выше в сравнении с прототипом 10-100 раз; используется мутагенное, действие обоих элементов фагоцитарной системы (ПМЛ и МФ) с участием естественных факторов регуляции фагоцитоза; заявляемое решение будет способствовать изучению генома вирулентности чумного микроба и других патогенных бактерий, популяционных взаимоотношений носителей и возбудителя чумы, решению проблемы возникновения экотипов возбудителя с различной вирулентностью, в природных очагах, что позволяет улучшить рациональную схему профилактики чумы.

Формула изобретения

Способ получения мутантов чумного микроба, предусматривающий обработку чумного микроба мутагенным фактором, высев на плотную питательную среду и отбор мутантов, отличающийся тем, что обработку чумного микроба осуществляют путем введения суспензии микроба в концентрации 1 10-1 108 м.к./мл в брюшную полость живым грызунам при экспозиции 1-6 ч, а плотную питательную среду засевают смытыми из брюшной полости микробами.

Таблица 1

Использование: микробиология, генетика бактерий, в частности моделирование мутационной изменчивости возбудителя чумы. Сущность изобретения: чумной микроб вводится непосредственно в брюшную полость живых грызунов с последующим смывом бактерий после забивки животных. Выход фагоцитов в брюшную полость стимулируется предварительным за 6 ч введением 5 мл 0,1 %-ного раствора гликогена, затем интра- перитонеально вводится 1-2 мл суспензии агаровой культуры бактерий в концентрации 1 107-1 108 м.к./мл. Смыв бактерий из брюшной полости производится 10,0 мл физиологического раствора с 0,25% ЭДТА с последующим высевом на твердые питательные среды и отбором мутантов. 2 табл.

Ауксотрофные мутанты чумного микроба, полученные при интраперитонеалном действии фагоцитов белой крысы на штамм Y.pestis A-1724

Сравнительная вирулентность для морских свинок мутантов штамма № 224, полученных при интраперитонеальном действии фагоцитов белых крыс

Таблица 2