Способ культивирования клеток животных в полимерных гранулах Советский патент 1992 года по МПК C12N11/08 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию иммобилизованных в полимерных гранулах клеток, и может быть использовано для получения физиологически активных веществ, продуцируемых клеткам, в особенности моноклонэльных антител, продуцируемых гибридомами.

Известен способ культивирования клеток в гранулах на основе альбумина, который заключается в том, что 5-25%-ный раствор альбумина смешивают с суспензией клеток в среде до конечной концентрации клеток 103-10 кл/мл, диспергируют полученную смесь в масло для создания дискретных белковых частиц, добавляют 0,01 %-ный раствор-сшивающего агента (се- бацилхлорида, адипйлхлорида), после сшив- ки образовавшихся гранул отмывают

гранулы с иммобилизованными в них клетками от сшивающего агента, а затем от мас- ла углеводородными растворителями, доводят рН среды до 7,0, помещают гранулы в среду для культивирования и инкубируют при37°С.

Недостатками этого способа являются многостадийность, связанная с необходимостью проведения многократных отмывок (от сшивающего агента, от масла, от органического растворителя), что приводит к нарушению целостности клеток, снижение количества жизнеспособных клеток из-за проведения процесса получения гранул с иммобилизованными в них клетками при неоптимальных для клеток условиях (рН) и использования токсичных углеводородных растворителей.

VI ГО

о

00 00

Известен способ культивирования клеток в гранулах из алыината кальция, который заключается в том, что 1,2-1,6%-ный водный раствор алыината натрия смешивают с суспензией клеток в среде (до конечной концентрации клеток 103-10 в зависимости от конкретной культуры клеток), полученную смесь выдавливают по каплям в 1,5- 2%-ный раствор осадителя (CaCte) для получения фазового разделения и образования гранул, далее проводят несколько раз промывку образовавшихся гранул с иммобилизованными в них клетками средой для культивирования, после чего помещают гранулы в среду и инкубируют при 37°С.

Недостатками известного способа куль-, тивирования являются многостадийность процесса, обусловленная необходимостью многократных отмывок от ионов кальция перед инкубированием гранул с иммобилизо- ванными клетками в среде, а также использование ограниченного набора сред и буферных растворов для культивирования иммобилизованных в гранулах клеток. Кроме того, способ невозможно реализовать в средах, содержащих фосфат- и цитрат- ионы, которые связываются с ионами Са2+, однако часто такие среды и буферы являются оптимальными для жизнедеятельности клеток. В известном способе происходит разрушение альгинатных гранул в аппаратах с перемешиванием, а также снижение количества жизнеспособных клеток, иммобилизованных в гранулы вследствие низкой прочности гранул, обусловленной диффузией ионов Са2+ в среду.

Целью изобретения является увеличение количества жизнеспособных клеток и упрощение способа.

Предлагаемый способ основан на том, что суспензию клеток смешивают с 2,5- 5,0%-ным водным раствором полимера класса N-виниламидов с мол.м, от 125000 до 1000000, содержащим 1-2% стабилизатора дисперсии, полученную суспензию клеток диспергируют непосредственно в среду для культивирования при 29-40°Сс целью образования полимерных гранул с иммобилизованными клетками - и инкубируют полученные с иммобилизованными клетками гранулы в среде.

Согласно изобретению в качестве стабилизатора дисперсии используют овальбу- мин, яичный порошок, Span-40 в виде растворов, которые добавляют к раствору полимера. В качестве полимера для получения гранул иммобилизованными клетками используют полимеры из класса N-виниламидов, в частности поли-М-винилкапролак- там (ПВК), сополимеры метилакрилата,

метилметакрилата, винилацетата с ПВК и N-виниламидами следующего строения:

-снг-снi-- °

/ R

U

RI

где, если RI - СНз, или С2Нб, или СзН, тогда R2 - СзН, или CaHs, или СНз соответствен0 но.

В литературе отсутствуют данные об использовании каких-либо полимеров класса N-виниламидов для получения иммобилизованных клеток.

5 Для иммобилизации используют клетки перевиваемой линии СНО (яичник китайского хомячка) либо гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела против мозаики резухи.

0 Клетки, освобожденные из гранул, окрашивают трипановым синим и подсчитывают их количество в камере Горяева. Индекс пролиферации (коэффициент прироста количества клеток) рассчитывают по отноше5 нию концентрации клеток, полученных на 6-е сутки инкубирования, к их посевной концентрации.

П р и м е р 1. 15 мл 8%-ного раствора поли -винилкапролактама с мол.м. 900000

0 стерилизуют автоклавированием, получают белый осадок полимера, декантируют воду и заменяют ее на среду для культивирования, либо стерильный фосфатный буфер (рН 7,0). После снижения температуры до ком5 натной получают раствор полимера; к которому добавляют 15 мл стерильного 2%-ного раствора овальбумина в 0,9%-ном KlaCI. К полученному водному раствору полимера, содержащему стабилизатор дисперсии (ко0 нечная концентрация полимера 4 %, а стабилизатора 1%), добавляют 10 мл суспензии клеток ЗВ4 (гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к вирусу мозаики резухи) в среде ДМЕМ (Gibco), содержа5 щей 10% фетальной сыворотки теленка. Полученную смесь (конечная концентрация клеток 5.105 кл/мл добавляют по каплям к 100 мл среды ДМЕМ при перемешивании и температуре среды 38°С, Полученные пол0 имерные гранулы с иммобилизованными в них клетками инкубируют в течение 6 дней в спиннерах (общий объем 250 мл, рабочий объем 100 мл) при 37°С при перемешивании со скоростью 120 об/мин. На 3-й сутки куль5 тивирования заменяют среду на 80%. По окончании процесса.среду декантируют, а гранулы выдерживают при комнатной температуре в течение 20-30 мин для их полного растворения. Коэффициент прироста количества клеток (индекс пролиферации)

определяют как описано. Данные по культивированию приводятся в табл.1.

П р и м .е р 2. Смесь для получения гранул с иммобилизованными клетками готовят по примеру 1, но при этом используют 15 мл 10%-ного раствора сополимера поли- N-винилкапролактама с винилацетатом (содержание винилацетата 20 мас.%) с мол.м. 125000 и 15 мл 3%-ного раствора яичного порошка. Полимерные гранулы получают в среде, подогретой до 29°С. Все дальнейшие операции гфоводят как в примере 1.

Пример 3. Готовят смесь суспензии клеток перевиваемой линии СНО (яичник китайского хомячка) с раствором полимера и стабилизатора дисперсии по примеру 1. При этом используют 15 мл 8%-ного раствора ПВК (мол.м. 400000) и 15 мл 4%-ного раствора яичного порошка. Полимерные гранулы получают, как описано в примере 1, но при температуре среды 40°С.

Пример 4. Смесь для получения полимерных гранул с иммобилизованными клетками ЗВ4 готовят по примеру 1, но при этом используют 15 мл 5%-ного раствора сополимера ПВК с метилметакрилатом (содержание метилметакрилата 15 мас.%) с мол.м. 500000 и 15 мл 2%-ного раствора яичного порошка. Гранулы получают при температуре среды 32°С. Все дальнейшие операции делают как в примере 1.

Пример 5. Смесь для получения гранул с иммобилизованными в них клетками ЗВ4 готовят по примеру 1, но при этом используют 15 мл 8%-ного раствора сополимера М-этил-М-виниламида масляной кислоты с метилметакрилатом (содержание метиламетакрилата составляет 15 мас.%) с мол.м. 300000 и 15 мл 4%-ного раствора Span-40. Гранулы получают при 40°С, далее все делают как в примере 1.

Пример б. Смесь для получения гранул готовят по примеру 1, но при этом используют 15 мл 10%-ного раствора сополимера N-метил- N-виниламида. масляной кислоты, с метилметакрилатом (содержание метилметакрилата составляет 15 мас.%) с мол.м. 250000 и 15 мл 3%-ного раствора Span-40. Гранулы получают при 40°С.

Пример 7. Смесь для получения гранул готовят по примеру 1, но при этом используют 15 мл 10%-ного раствора сополимера М-этил-М-виниламида пропионовой кислоты с метилакрилатом (содержание ме- тилакрилата 15 мас.%) с мол.м. 300000 и 15 мл 3%-ного раствора овальбумина. Гранулы получают при 40°С, а все дальнейшие операции проводят как в примере 1.

Пример 8. Смесв для получения гранул с иммобилизованными клетками готовят по примеру 1, но при этом используют 15 мл 5%-ного раствора ПВК с мол.м. 1000000 и 15 мл 4%-ного раствора яичного порошка. Гранулы получают при 38°С, а да- 5 лее все делают по примеру 1.

Пример 9 (по известному способу). Готовят 30 мл стерильного 2%-ного раствора альгината натрия (фирма Bellco) в 0,9%-ном растворе NaCI. К полученному раствору полиме0 ра добавляют 10 мл суспензии клеток ЗВ4 в среде ДМЕМ, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка (конечная концентрация клеток 5.104 кл/мл). Полученную смесь добав- ляют по каплям в 100 мл 1,6%-ного раствора

5 СаС12. Полученные гранулы из альгината кальция с иммобилизованными в них клетками 4 раза отмывают средой, затем декантируют среду, а полимерные гранулы помещают в 100 мл среды ДМЕМ и инкубируют в спиннере

0 при 37°С по примеру 1.

По окончании процесса среду декантируют, добавляют 20 мл стерильного 50 мМ раствора цитрата натрия для разрушения капсул. Освобожденные из гранул клетки

5 окрашивают трипановым синим и подсчитывают их количество в камере Горяева.

Все результаты по культивированию клеток в полимерных гранулах, полученных по примерам 1-9, приведены в таблице..

0 Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет упростить способ культивирования клеток в полимерных гранулах, увеличить количество жизнеспособных клеток, выросших в них на 10,7-16,6%, а также

5 расширить ассортимент сред, которые могут использоваться при таком способе культивирования.

Формулаизобретения

1.Способ культивирования клеток живо0 тных в полимерных гранулах, предусматривающий смешивание суспензии клеток с водным раствором полимера, введение этой смеси в гидрофильную фазу для получения гранул полимера с иммобилизованными

5 клетками и инкубацию их в питательной среде, отличающийся тем, что, с целью повышения количества жизнеспособных клеток и упрощения способа, в качестве водного раствора полимера используют 2,50 5,0%-ный раствор полимера класса N-виниламидов с мол.м. 125000-1000000, в который дополнительно вводят стабилизатор дисперсии в концентрации 1-2%, а гидрофильной фазы - питательную .среду для

5 культивирования этих клеток с температурой 29-40°С.

2.Способ по п. 1,о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве стабилизатора дисперсии используют овальбумин, яичный порошок или Span-40.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию иммобилизованных в полимерных гранулах клеток животных. Цель изобретения - повышение количества жизнеспособных клеток и упрощение способа. Способ заключается в смешивании суспензии клеток животных с 2.5-5,0%-ным раствором полимера класса N-виниламидов с мол.м. 125000-1000000, в которой дополнительно введен стабилизатор дисперсии в концентрации 1-2%, введении этой смеси в гидрофильную фазу для получения гранул полимера с иммобилизованными клетками с последующим инкубированием их в питательной среде. Причем, в качестве стабилизатора дисперсии используют овальбумин, яичный порошок или Span-40, а в качестве гидрофильной фазы - питательную среду для культивирования этих клеток с температурой 29-40°С. 1 з.п.ф- лы, 1 табл. fe