Способ выявления антигена менингококка серотипа С Советский патент 1992 года по МПК G01N33/535 

(/)

С

Изобретейие относится к биологии и медицине, может быть использовано Для выявления антигенов менингококка С в биологических жидкостях с помощью кодиаг- ностикума. Цель изобретения - упрощение способа и повышение его чувствительности. Сущность изобретения заключается в том, что используют 2%-ный стафилококковый реагент, содержащий белок А, который является иммуносорбентом и одновременно твердофазным носителем. Сенсибилизацию осуществляют асцитной жидкостью мышей, содержащей специфические антитела с титром 1:64. Реакционный комплекс дополнительно обрабатывают кроличьей пре- ципитирующей противоменингококковой сывороткой при рН 7,0. В качестве перокси- дазного конъюгата используют антивидовые антитела.

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для выявления антигенов менингококка С в биологической жидкости с помощью кодиагностикума.

Известен способ определения антигена менингококков А и С в биологической жидкости на основе прямого метода с применением полистероловой пластины как твердофазного носителя, очищенных проти- воменингококковых антител, а также приготовления конъюгата этих же антител с пероксидазой. При постановке иммунофер- ментного анализа (ИФА) в лунки пластин, сенсибилизированных антителами, добавляют исследуемый материал (спинномозговую жидкость, СМЖ), в которой предполагается наличие антигенов. После отмывки от несвязавшихся белков в лунки

серологических пластин вносят конъюгат с пероксидазой. Пластины отмывают буфером от несвязавшихся антител и в лунки добавляют раствор 5-аминосалициловой кислоты с перекисью водорода. При наличии в СМЖ менингококковых антигенов в соответствующих лунках серологических пластин появляется окрашивание раствора, интнёсивность которого зависит от концентрации антигена.

Недостатком известного способа является необходимость тщательной очистки антител, часть из них необходимо связать с пероксидазой. В данном методе применяется прямой иммуноферментный анализ, что менее чувствительный по сравнению с непрямым методом. Очистка антител и привязка пероксидазы довольно сложные процедуры и требуют специальной аппаратуры.

ч|

го со

СЛ

го

СЛ

Цель изобретения - упростить способ и повысить чувствительность.

Указанная цель достигается тем, что антитела из иммунных биологических жидкостей (иммунная асцитическая жидкость, сыворотка крови, моноклональные антитела) адсорбируют стафилококковым реактивом, содержащим белок А,

Существенное отличие предлагаемого способа заключается в том, что стафилококковый реактив, содержащий белок А, является иммуносорбентом и одновременно твердофазным носителем.

Способ осуществляют следующим образом.

Из музейной культуры менингококка серотипа С делают вакцину следующим образом. Взвесь односуточной культуры менингококка в физиологическом растворе в концентрации 1 х 109 микробных тел в 1 мл прогревают при 60°С на протяжении часа и добавляют фенола до конечной концентрации в 0,25%. Вакцину проверяют на бактериологическую чистоту и делают биопробу на мышах. После контроля проводят вакцинацию безлинейных белых мышей.

Были испытаны различные концентрации вакцины и различные сроки вакцинации. Оптимальным вариантом оказалась доза в 0,1 мл, вводимая через 7 дней внут- рибрюшинно шестикратно. Для получения иммунной асцитической жидкости (ПАЖ) через 3 дня .после последней иммунизации вводили внутрибрюшинно клетки саркомы 180-TG. Штамм этих клеток поддерживали в пассажах на взрослых мышах путем внут- рибрюшинных прививок. От одного животного получали 6-8 мл асцита. Титры антител в пуле ИАЖ имел значение в РСК 1:64. При повторных пункциях титр проти- воменингококковых антител падал. ИАЖ от повторных пункций не использовали.

На следующем этапе к 1 мл ИАЖ добавляли равное количество 2%-ной взвеси стафилококкового реагента, содержащего белок А в 0,1 М фосфатном буфере при рН 8,0. При таких условиях стафилококковый реагент связывал иммуноглобулин ИАЖ. Об этом свидетельствовал электрофоретиче- ский анализ ИАЖ, проведенный до и после ее инкубации со стафилококковым реагентом. Электрофорез ИАЖ после инкубации не выявлял 1g G. Другим подтверждением являлось отсутствие антител в ИАЖ после инкубации со стафилококковым реагентом при постановке РСК. На этом этапе получали кодиагностикум..

Кодиагностикум сохраняли при 4°С в виде 10%-ной взвеси. Способности иммунного реагента кодиагностикум сохранял и через 10-12 мес хранения.

Для выявления предполагаемого антигена, 0,5 мл СМЖ центрифугировали при

3000 об/мин на протяжении 5 мин. К над- осадочной жидкости добавляли 1 мл 1%-ной взвеси кодиагностикума и инкубировали смесь при 37°С на протяжении 30 мин, периодически перемешивая. Взвесь центрифугировали при 3000 об/мин, отмывали от несвязавшихся белков фосфатным буфером при рН 8.0. К осадку добавляли 0,2 мл стандартной преципитирующей противоменин- гококковой сыворотки к серотипу С при рН

7,0; инкубировали 30 мин при 37°С. Осадок снова отмывали от несвязавшихся белков и к осадку добавляли антитела диагностические против иммуноглобулинов кролика меченные пероксидазой хрена (производства

Ленинградского НИИ вакцин и сывороток). В предварительных исследованиях находили оптимальное разведение диагностических антител,. Чаще всего применяли разведение 1:20, Взвесь инкубировали

30 мин при 37°С, отмывали от несвязавшихся белков и обрабатывали проявляющей смесью. Проявляющая смесь состоит из 0,3%-ного раствора перекиси водорода и раствора 5-аминосалициловой кислоты (1 мг

на 1 мл дистиллированной воды). Раствор

аминосалициловой кислоты доводили до рН

6,0 1 Н гидроокисью натрия (рН 6,0 имеет

очень важное значение для выявления пероксидазы). В пробирке с кодиагностикумом, при наличии антигена менингококка серотипа С в СМЖ, будет образовываться коричневый цвет раствора через 10-15 мин после добавления проявляющей смеси. Количественные изменения можно определить на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Контролем служит кодиагностикум без СМЖ, а также диагностические антитела, меченные пероксидазой хрена, и проявляющая смесь.

Предлагаемый способ упрощает выявление антигена менингококка серотипа С, так как исключает специальную очистку антител и присоединение к ним пероксидазы, дает возможность использовать мышей (которые дешевле кроликов) и применять непрямой иммуноферментный анализ (который в 10 раз чувствительнее прямого метода).

Фор мула изобретения

Способ выявления антигена менингококка серотипа С, включающий сенсибилизацию носителя антителами, внесение исследуемого антигена, добавление перок5 17235256

сидазного конъюгата и учет реакции, о т л и-менингококкусеротипа С в титре 1:64, после

чающийся тем, что, с целью упрощениявнесения исследуемого антигена реакционспособа и повышения его чувствительности,ный комплекс дополнительно инкубируют в

в качестве носителя используют 2%-ныйприсутствии кроличьей антименингококкостафилококковый кодиагностикум, сенси-5 вой преципитирующей рыворотки при рН

билизацию осуществляют асцитной жидко-7,0 и в качестве пероксидазного конъюгата

стью мышей, содержащей антитела кдобавляют антивидовые антитела.