Способ анализа антигенов Советский патент 1987 года по МПК G01N33/53 

Иаобретение относится к способам анализа- антигенов и может быть применено в практике здравоохранения для диагностики инфекционных заболеваний, стандартизации вирусных препаратов, контроля загрязнения окружающей среды, а также в научных целях (серотипирование выявляемых штаммов, изучение структуры антигенных детерминант и т. д.).

Цель изобретения - упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Стафилококковый реагент готовят заблаговременно или непосредственно перед проведением анализа. Культуру стафилококка штамм Cowan 1, выращенную в течение 12-18 ч, осаждают центрифугированием при 3000 об/мин 15 мин и дважды отмывают от питательной среды в 0,01 М фосфатно- солевом буфере (ФСБ). Эти и все последующие процедуры отмывания стафилококка осуществляют путем осаждения бактерий при 3000 об/мин 15 мин и ресуспендирования осадка в ФСБ. Затем взвесь бактерий фиксируют раствором формальдегида в концентрации от 0,3 до 3% в течение 0,5-3 ч. Фиксацию ведут при постоянном перемешивании. Затем стафилококк 3-4 раза отмывают в ФСБ от формальдегида и прогревают 1 час при 80°С для снижения протеоли- тической активности, после чего суспензию отмывают еще раз в ФСБ и доводят до Ю /о-ной концентрации. При необходимости длительного хранения во взвесь стафилококка добавляют мертиолят натрия или азид натрия в конечной концентрации 1:1000 1:10000.

Для приготовления стафилококкового реагента можно также использовать лио- филизированный препарат стафилококка Ленинградского института им. Пастера. Его регидратируют в дистиллированной воде, 1-2 раза отмывают в ФСБ и доводят до Ю /о-ной концентрации.

С целью упрощения регистрации анализов суспензию стафилококка перед сенсибилизацией специфической сывороткой окрашивают метиленовым синим. К 1 мл 10°/о-ной суспензии добавляют 0,1 мл красителя, разве денного ФСБ 1:100. Окрашенные бактерии позволяют учитывать результаты при обычном (падающем или проходящем) освещении на светлом фоне, тогда как и при использовании неокрашенных требуется осветитель для создания условий, приближающихся к полному внутреннему отражению, а на- подбор этих условий уходит дополнительное время.

Сенсибилизацию стафилококка проводят следующим образом.

К 0,2-0,3 мл гипериммунной сыворотки проти в ротавирусов, не содержащей антител, к стафилококку и разведенной ФСБ 1:100 добавляют 0,5-1 мл Ш /о-ной взвеси

стафилококка, обработанного указанным способом, тщательно пере.мешивают и через 15-30 мин после однократного, отмывания в ФСБ и осаждения центрифугирова- при 3000 об/мин в течение 15 мин (либо при 10000 об/ми1 30 с) добавляют 10 мл 0,01 М ФСБ с 0,05% твин 20 и 0,50/о- /о-на го бычьего сывороточного альбумина.

На поверхность твердой фазы, способ- Q ной сорбировать антитела (микротитраци- онные полимерные панели с U -образными лунками, полимерные пробирки и т.п.), наносят раствор специфической гипериммунной сыворотки, выдерживают 2-3 ч для адсорбции антител при 37°С на твердой 5 фазе. Несвязавшиеся антитела удаляют промыванием. В качестве промыаочного раствора можно использовать 0,05-0,01 М ФСБ (рН 7,2-7,4) или. гфиготовленные на этом буфере 0,05-О.Б /о-ные растворы по- Q верхностно-активных веществ (твин 20, ОП-7 и т.п.), 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина. После зп ого к сорбированным на твердой фазе антителам добавляют раствор исследуемого антигена. Время образования комплексов антиг ен- 5 антитело при 37°С составляет 1-2 ч. Несвязавшийся антиген и сопутствующие примеси удаляют трехкратным (2-3 мин) промыванием указанным буфером.

После этого добавляют гстовый стафилококковый реагент. Бремя контакта стафилококкового реагента 1-2 часа при 37°С с последующим помещением на холод при -f4°C. Результаты реакции учитывают визуально через 3-5 ч после внесения реагента или на следующий день. Реакцию учитывают следующим образом. 4+ - резко положительная реакция: агглютинированные бактерии образуют перевернутый «зонтик, края которого опадают. 3+ положительная реакция: агглюти- 0нированные бактерии образуют

перевернутый «зонтик с ровными краями.

Я+ - слабо положительная реакция: на дне лунки наряду с «зонтиком 5намечается образование диска из

неагглютинированных бактерий. i+ -сомнительная реакция: по периферии образовавшегося диска .и не- агглютинированных бактерий незначительная зона из агглютини- 0 ,рованных бактериальных клеток.

- -отрицательная реакция: бактерия полностью оседает на дно лунки в виде диска.

Сыворотки, используемые в предлагаемом способе, не должны содержать анти- 5 тел к стафилококку. Для этого проводят контроль путем смешивания на предметном стекле по 1 капле сыворотки и 10 /о-ной суспензии стафилококка. Если через

0

3-5 мин не происходит образования агглю- тинатов, сыворотку считают пригодной.

Пример 1. Анализ антигена ротавирусов в культуре клеток. Стафилококковый реагент готовят непосредственно перед проведением анализа из 10%-ной суспензии стафилококка, как описано.

В полистирольную панель сU-образными лунками вносят по 75 мкл гипериммунной сыворотки, разведенной 0,01 М ФСБ 1:2000. Титр гипериммунной сыворотки морской свинки, иммунизированной ротавиру- сом, в реакции торможения гем агглютинации равен 1:2560. В контрольные лунки вносят по 75 мкл нормальной сыворотки, не содержащей антител к ротавирусам, в тех же разведениях. Панели инкубируют при 37°С 2-3 ч. Несорбированные антитела удаляют из лунок постукиванием панели по фильтровальной бумаге лунками вниз. Лунки панели трижды промывают 0,01 М ФСБ с 0,05% твин 20 {контакт 2-3 мин). После этого в лунки вносят по 50 мкл раствора исследуемых ротавирусных антигенов в серийных двухкратных разведениях. Антигены - это лизаты клеточных культур, зараженных ротавирусами. Парал.тельно вносят по 50 мкл для контроля в серийных двукратных разведениях ,лизаты незараженных клеток. Панель с антигенами инкубируют 1-2 ч при 37°С . Несвязавшиеся антигены и посторонние примеси удаляют четырехкратным промыванием 0,01 М ФСБ с 0,05% твин 20. Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл 0,5%-ной взвеси стафилококкового реагента. Панели выдерживают 1-2 ч при 37°С с последующим помещением на холод при -f4°C. Учет реакции производят через 3-5 ч или на следующий день после внесения реагента. Титром антигена считают наибольшее его разведение, которое вызывает агглютинацию бактерий на 2 + . Результаты анализа определяют визуально.

Параллельно определяют титры исследуемых антигенов известным способом ИФА.

Пример 2. Анализ ротавирусных антигенов в фокальных экстрактах больных острым гастроэнтеритом. Анализ проводят как описано в примере 1. Для исследования на наличие антигенов ротавируса берут 10- 20% на 0,01 М ФСБ фокальные суспензии больных гастроэнтеритом. Для контроля используют суспензии фекалий, не содержащих ротавирусных антигенов. Результаты анализов учитывают визуально. Положительной считают реакцию агглютинации стафилококка на 2+ и более. Всего исследовано 107 образцов.

Пример 3. Типирование культуральных антигенов ротавируса человека. Анализ проводят,как описано в примере 1. Для исследования берут лизаты клеток культуры ткани после трехкратного замораживания

и оттаивания. Для контроля используют полученные таким же образом культураль- ные антигены ротавируса обезьян и ротавируса свиньи. Гиперим.мунные сыворотки

морских свинок (серии 27, 28 и 310), полученные к трем вариантам ротавируса человека 1836, 5 и 1А, используют для сенсибилизации панелей и стафилококка в разведениях 1:3000. Положительной считают

0 реакцию агглютинации на 2+ и более.

Пример 4. Титрование антигенов вируса полиомиелита I, II, III типов. Анализ -uu)- водят,как описано в при.мере 1. Для исследования берут культуральные антигены вируса полиомиелита I типа штамм Магоней, II типа штамм Смирнов, III типа штамм Саукет и моновалентные диагностические коммерческие сыворотки с рабочим р,:3ве- дением для реакции нейтрализации 1:20; 1:40; 1:40 соответственно для каждого типа.

0 В предлагаемом способе сыворотки каждого типа используют в разведении 1:1000 для сенсибилизации панелей и стафилококка. В качестве контроля антигенов берут лизаты незараженных клеточных культур

с в тех же разведениях.

Результаты анализа определяют визуально. Титром антигена считают наибольшее его разведение, которое вызывает агглютинацию стафилоко.чка на 2 + : для типа I - 1:64, для типа I - 1:32 и для типа

0 III - 1:16.

Пример 5. Анализ антигена вируса гепатита А. Анализ проводят как в примере 1. Для исследования берут культуральный антиген вируса гепатита А в двухкратных серийных разведениях 1:25 - 1:1600. Для

5 сенсибилизации панелей и стафилококка используют 1 gG в разведении 1:100. В качестве контролей берут лизат незараженной культуры клеток. Титр антигена, определяемый визуально предлагаемы.м способом,

Q равнялся 1:400. При исследовании этого же антигена в ИФА титр равнялся 1:1600. Использование в предлагаемом способе стафилококка иск тючает применение дефицитных реактивов: высокоочищенной и высокоактивной пероксидазы хрена, хромоген5 ного субстрата, состоящего из ортофени- лендиамина, лимонной кислоты и перекиси водорода, реактивов и специального оборудования, необходимых для конъюгации фермента с IgG. Замена фермента исключает наиболее сложную и нестандартную опера0 цию по проведению хромогемной реакции.

Предлагаемый способ позволяет использовать специфические сыворотки, не выделяя из последних IgG. В ИФА для получения конъюгата используют очищенный IgG.

5 Быстрота приготовления реагента (15- 30 мин) из фиксированного стафилококка расширяет диапазон диагностических возможностей способа. Приготовление конъюгата в ИФА занимает 3 сут.

s

Окрашивание стафилококка метялено- вым синим упрощает регистрацию анализа, так как позволяет оценивать результат при обычном освещении на светлом фоне, тогда как для учета агглютинации неокрашенных бактерий требуется осветитель для создания условий, приближающихся к полному внутренне.му отражению, а на подбор этих условий уходит дополнительное время.

Использование лиофйлизированного стафилококка, сенсибилизированного специфическими сыворотками, позволяет применять предлагаемый способ в любой клинической лаборатории и даже в полевых условиях.

Предлагаемый способ анализа антигенов может найти широкое применение в раз

6

личных областях здравоохранения, биологии, ветеринарии, сельского хозяйства.

Формула изобретения

Способ анализа антигенов путем внесения исследуемого образца к специфическим антите. гам, сорбированным на твердой фазе с последующим добавлением вторичных специфических антител и выявлением антигенов, отличающийся тем, что, с целью упрощения анализа, перед добавлением специфических BTOpHuijbix антител их предварительно связывают с протеином А staphytoco- ciis aureus щтамма Cowan 1, при зтом бак- терпи окрашивают водорастворимым красителем и выявление антигенов осуществляют визуаль 1о по реакции агглютинации бактерий.

Изобретение относится к способам анализа антигенов, предназначено для диагностики инфекционных заболеваний, стандартизации вирусных препаратов, контроля загрязнения окружающей среды и для научных исследований (серотинирование выявляемых штаммов, изучение структуры антигенных детерминант). Цель изобретения - упрощение способа. Для этого культуру стафилококка щтамм Cowan 1 осаждают центрифугированием при 3000 g 15 мин, ресуспендируют осадок в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), взвесь бактерий фиксируют 0,3-З /о-ным раствором формальдегида 0,5-3 ч. Стафилококк 3-4 раза отмывают в ФСБ от формальдегида и прогревают 1 ч при 80°С для снижения протеолитической активности, затем суспензию вновь отмывают в ФСБ и доводят до 10%-ной концентрации. При длительном хранении во взвесь стафилококка добавляют мертиолят натрия или азид натрия в конечной концентрации 1:1000- 1:1000й Выявление антигенов осуществляют визуально по реакции агглютинации. САЗ to 00 со 05