Способ определения активности киллеров Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано при диагностике нарушений активности естественных киллеров у обследуемых лиц.

Цель изобретения - повышение точности способа и ускорение анализа.

Способ осуществляют следующим образом.

У обследуемого производят забор крови, выделение взвеси клеток-эффекторов в градиенте плотности, добавление к ним клеток К-562, инкубацию в среде, регистрацию гибели клеток К-562 в смеси и по величине гибели их определяют активность киллеров. Предварительно из взвеси клеток-эффекторов удаляют макрофаги, клетки К-562 дополнительно очищают в градиенте плотности

центрифугированием и добавляют 80.000- 120.000 клеток мл до соотношения с клетками-эффекторами, равного 1:15-25, затем смесь клеток вносят в среду, содержащую 0,5-0,6% агара и 0,1-0,2% трипанового синего, заполняют капилляр, закрывают концы капилляра, инкубируют в течение 4-5 ч, а гибель регистрируют путем подсчета прокрашенных клеток.

В предлагаемом способе в качестве эффекторов используют чистую лимфоцитар- ную взвесь.

П р и м е р 1. Клетки-мишени К-562 (Catalogeof cell Lihes Hybridomas), постоянно культивируемые in vitro известным образом в полной питательной среде, извлекают из нее. Перед работой суспензию К-562, взяXJ

ю

vj О XI

00

тую на 2 сут после пересева, наслаивают на Ficoll-Hypague (d 1,077 г/см3) и центрифугируют при 300 хд в течение 25 мин на центрифуге ОС- 6 М. Подобная манипуляция необходима для удаления нежизнеспособных клеток (вследствие своей повышенной плотности они оседают на дно).

В данном случае до постановки цито- токсического теста определяют процент жизнеспособных К-562, который оказался не меньше 95% (с помощью известного метода по исключению 0,1%-ного раствора трипановой сини). После извлечения интерфазы автоматической пипеткой в пробирку и 2-кратного отмывания клеток в питательной среде составляют клеточную суспензию (путем подсчета в камере Горячева) в концентрации 120000 кл/мл в полной питательной среде следующего состава:

Сыворотка эмбрионов коров (СЭК, коммерческая)5 мл

. Глютамин0,04 г

Гентамицин40 мкг/мл

Среда RPMI-1640До 100 мл

Далее проводят выделение клеток-эффекторов. Для этого кровь, взятую из вены обследуемого на гепарине в количестве 5 мл и разведенную в 2 раза средой 199, наслаивают на градиент Ficoll-Hypague (d 1,077 г/ см3) и центрифугируют при 300 в течение 30 мин при t 20°C. Интерфазное кольцо собирают, дважды отмывают питательной средой и наносят на пластиковую поверхность, например, фирмы Flou (США), предварительно обработанную 20%-ной СЭК в полной питательной среде.

По истечении 1 ч инкубации при т 37°С суспензию неприлипших клеток (лимфоциты) сливают в отдельную пробирку, отмывают питательной средой, просчитывают количество лимфоцитов в камере Горячева и составляют концентрацию 1,8 10 кл/мл.

В лунки круглодонных пластин для иммунологических реакций вносят по 0,1 мл клеточных суспензий лимфоцитов и клеток- мишеней К-562 в соотношении соответственно, равном 15:1 (180000 клеток-эффекторов и 12000 клеток-мишеней).

Пластины центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, надосадок удаляют полностью и к клеточному осадку, оставшемуся в лунках пластин, добавляют 50 мкл предварительно приготовленной смеси, которую получали следующим образом.

Брали навеску агара (Difco) в 30 мг. Добавляли к ней 1 мл полной питательной среды следующего состава:

СЭК (коммерческая) 15мл

Глютамин 0,06 г

Гентамицин50 мкг

Среда 199До 100 мл

выдерживали 30 мин и в водяной бане доводили смесь до состояния геля. Далее при Т°

геля 50°С добавляли 4,0 мл питательной среды вышеуказанного состава (0,6% агара), содержащей 0,005 г трипановой сини (0,1%).

Полученную смесь с клеточным осадком

0 осторожно ресуспендируют при 37°С. Два 5-канальных плоских капилляра длиной 1- 1,5 см и 0,25 мм опускают в приготовленную смесь (t° + 37°C), содержащую клеточную взвесь.

5 После заполнения капилляров смесью их концы закрывают пластилином или воском, капилляры помещают в чашки Петри и инкубируют при 37°С в течение 4 ч.

Параллельно проводят инкубацию кон0 трольных капилляров. В качестве контроля выступает чистая культура К-562, помещенная в те же условия. По окончании инкубации капилляры просматривают под световым микроскопом (8 х 20). Просчитыва5 ют число окрашенных (мертвых) клеток К- 562 по всей длине 10 каналов 2 капилляров и рассчитывают процент прокрашенных клеток. Среднее арифметическое результатов, полученных в 10 каналах, прямо про0 порционально соответствует активности киллеров.

Обсчет результатов проводили согласно стандартным методам вариационной статистики.

5Разброс результатов определения активности киллеров в прототипе в соотношении 25:1 составил 9-64%, т.е. более чем 7-кратный, а в предлагаемом способе - 14- 26%, т.е. менее чем 2-кратный. Точность,

0 таким образом, в предлагаемом способе при соотношении 25:1 выше в 3,5 раза.

При соотношении 15:1 разброс в прототипе составил от 5 до 24%, т.е. более чем 4-кратный, а в предлагаемом способе раз5 брос оставил 8-17%, т.е. почти 2-кратный. Точность, таким образом, в предлагаемом способе при соотношении эффектор:ми- шень 15:1 выше в 2 раза.

Таким образом, в предлагаемом спосо0 бе результат цитотоксического действия ЕК фиксируется визуально, т.е. определяется глазом прямой эффект цитотоксического действия. В прототипе и аналоге этот эф- фект отражается косвенно либо по выходу i.

5 81Сг, либо по выходу фермента из клеток- С мишеней. Поэтому несмотря на объективный учет интенсивности -излучения на счетчике радиоактивности или степени ферментативной реакции на спектрофотометре, результат предлагаемого капиллярного

теста будет ближе к ситуации в организме (in vivo), что повышает его точность в диагностическом плане.

Предлагаемый способ занимает значительно меньше времени (в 4-4,5 раза) по сравнению с прототипом. На проведение известного метода требуется 48 ч, а на предлагаемый 10-12 ч. Это обстоятельство позволяет использовать способ при массовом обследовании населения, при этом за 1 рабочий .день можно оценить МК-активность предлагаемым способом у 10-15 человек, а по прототипу получить результаты можно только через 2 сут.

Формула изобретения Способ определения активности киллеров, включающий забор крови, выделение клеток-эффекторов в градиенте плотности,

5

инкубацию их в присутствии клеток К-562 с последующей регистрацией гибели клеток К-562, по количеству погибших клеток определяют активность киллеров, отличающийся тем, что, целью повышения точности способа и сокращения времени анализа, после выделения клеток эффекторов отделяют от них путем инкубирования на пластике макрофаги, клетки К-562 перед инкубацией с клетками-эффекторами дополнительно очищает центрифугированием в градиенте плотности, добавляют их в количестве 80000-120000 клеток/мл к клеткам-эффекторам до соотношения 1:15-25, инкубируют в среде, содержащей 0,5-0,62 агара и 0,1- 0,2% трипанового синего в капилляре с закрытыми концами в течение 4-5 ч, а гибель клеток регистрируют подсчетом окрашенных клеток.

Изобретение относится к клинической, иммунологии. Цель изобретения - повышение точности способа, а также сокращение времени анализа. Из крови обследуемых выделяют клетки-эффекторы в градиенте плотности, освобождаются от макрофагов путем их прилипания к пластику. Затем клетки-эффекторы смешивают с клетками мишенями К-562, дополнительно очищенных в градиенте плотности. Смесь клеток помещают в питательную среду, содержащую 0,1-0,2% трипановой сини.и 0,5-0,6% агара. Соотношение эффектор:мишень составляют равным 15-25:1. Клеточную взвесь в среде упомянутого состава помещают в плоский капилляр. Концы капилляра закрывают и инкубируют в течение 4-5 ч при37°С. По окончании инкубации под микроскопом просчитывают процент прокрашенных клеток-мишеней К-562. Этот процент отражает функциональную активность киллеров. По сравнению с прототипом увеличивается точность способа в 2-3,5 раза с сокращением времени анализа в 4-4,5 раза.