Способ определения хемотаксиса лейкоцитов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано при диагностике нарушения хемотаксиса лейкоцитов у обследуемых лиц.

Целью изобретения является повышение точности и увеличение производительности способа определения хемотаксиса.

Способ осуществляется следующим образом.

Объектом исследования служит гепаринизированная кровь в количестве 2 мл, ко-, торую смешивают с 2 мл 1 %-ной желатины, отстаивают при 37°С в течение 10-15 мин. Надосадок извлекают, отмывают в среде 199, просчитывают клетки и составляют клеточную взвесь с концентрацией 1 млн./мл. . Затем готовят состав для заполнения капилляров. Для этого берут навеску 20 мг порошка агара (Difeo). К ней добавляют 1 мл среды 199. Выдерживают смесь в течение 20 мин

при комнатной температуре для набухания и пропитывания агара. Затем агар в среде 199 помещают в водяную баню, где при температуре кипящей воды происходит расплавление агара. Далее золю агара дают остыть до 50-55°С и в него вносят при перемешивании 1 мл среды 199, содержащей 0,16 мл (8%) эмбриональной телячьей сыворотки,0,0008 г(0,04%)глютаминовой кислоты и 0,0172 мг(из расчета 0,86 мг на 10 мл среды) М-формилметиониловых пептидов.

Капилляры плоские, 5-канальные,0,25 мм, заполняют агаровым золем, для чего их опускают в вертикальном положении в вышеописанный состав, представляю1ций собой жидкость (t-50-55°C). Для застывания жидкости в капилляре их оставляют при комнатной температуре, после чего извлекают. Далее клеточную взвесь раскапывают по 0,1 мл в лунки планшет. Туда же в вертикальной позиции помещают,капилляры опытные и контрольные. Инкубируют 10 ч, извлекают капилляры и измеряют длину пробега мигрировавших клеток с помощью микроскопа с окуляром-микрометром (ув. 10x25).

П р и м е р -1. Нейтрофильную взвесь получают путем седиментации на градиенте плотности MPR-M. Чистота/выделенных нейтрофилов составила 95-98%, жизнеспособность 98% по исключению трипанового синего. Осуществление способа отличается от описанного в примере тем, что нейтрофилы вносят в лунки планшет В количестве 1,5 млн/мл.

Капилляры заполняют смесью следующего состава: эмбриональная телячья сыворотка 13 мл, глютаминоаая кислота 0,06 г. N-формилметиониловые пептиды 0,0086 мг, агар 0,8 г, среда 199 до 100мл, а инкубацию проводят в течение 8 ч. ,

Результаты опыта по определению длины пробега в 10 каналах капилляров представлены в табл.1.

Результаты миграции нейтрофилов из чистой взвеси представлены в табл. Nfe 2. Результату, указанные в таблицах и примерах, соответствуют числу делений линейки в окуляре при увеличении, окуляр 10, обьектив - 25. При необходимости для перевода результатов в миллиметры, полученные значения делят на 25. Разбросы определения миграций в каналах капилляра составляют 1,6-3%, Результат фиксируется в виде средней арифметической,

Сравнительный анализ предлагаемого способа и способа-прототипа представлен в табл. 3.

Под порядковыми номерами (1,2 и т.д.) представлены по способу-прототипу абсолютное количество мигрированных клеток на обратной стороне мембраны, а по предлагаемому способу - длина пробега с помощью окуляра-микрометра (ув. 10X25).

Как видно из таблицы, ошибка опыта способа-прототипа превосходит ошибку предлагаемого способа в 3-5 раз при определении хемотаксиса, т.е. точность предлагаемого способа в 3-5 раз выше по .сравнению со способом-прототипом.

Формула изобретения

Способ определения хемотаксиса лейкоцитов, включающий их выделение и определение длины пробега мигрирующих клеток, отличающийся тем. что, с целью повышения точности способа и увеличения его производительности, лейкоциты в количестве 1,0-1,5 млн.наносят в лунки планшет с питательной средой, в них в вертикальной позиции размещают капилляры, заполненные средой, содержащей в 100 мл эмбриональную телячью сыворотку 8-13 мл, глютаниновую кислоту 0,04-0,06 г, N-формил-метиониловые пептиды 0,0086-0,86 мг, агар 0,8-1 f, инкубируют в течение 8-10 ч, извлекают капилляры и измеряют длины пробега мигрирующих клеток с помощью микроскопа с окуляром-микрометром.

Таблица

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии. Целью изобретения является повышение точности и производительности определения миграцииклеток при иммуноэпидемиологических исследованиях. Выделенные из крови обследуемых лиц лейкоциты в количестве 1,0-1,5 млн/мл вносят в лунки планшет, содержащие питательную среду, с размещенными в них несколькими капиллярами. Капилляры предварительно заполняют составом, содержащим агар и питательную среду при их соотношении соответственно равном

М 23,6,- (,1: т-0,66. Ошибка опыта Р - 100 % 2,7 %.

М + т

Таблица 2

М 727.000 (.620 .663 Р 9% С внесением ХА.

Таблица 3

М 23.6 (.2 m 0.66 Р - 2.7 %