Способ хроматографического опредения витамина D @ в кормовых дрожжах Советский патент 1992 года по МПК G01N30/02 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам определения витамина D2 в биомассе, и может быть использовано при производстве дрожжей, обогащенных витаминов D2.

Известен полуколичественный способ определения витамина D2 в кормовых дрожжах методом тонкослойной хроматографии, основанный на определении последнего по интенсивности окраски и величине пятен, полученных на хроматограмме.

Наиболее близким к изобретению является способ хроматографического определения витамина D2, включающий экстрагирование стероидной фракции органическим растворителем (серным эфиром), разделение компонентов смеси с помощью тонкослойной хроматографии. По полученным хроматограммам определяют оптическую плотность экстракта, нанесенного на хроматографическую пластинку, соответствующую определенному количеству витамина D2.

Недостатками этого способа являются его сложность, применение дефицитных реактивов (дигитонин), неселективность.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение его селективности.

Поставленная .цель достигается тем, что согласно способу анализируемые кормовые

VI

Ю 00 XI Ю

дрожжи первоначально растворяют в спиртовом растворе щелочи, кипятят и затем гидролизат экстрагируют органическим растворителем. После экстрагирования стероидной фракции осуществляют ее обра- ботку насыщенным раствором иода в гексане до появления розового окрашивания с последующей отгонкой растворителя. Далее к сухому остатку добавляют до смачивания бензол и гексан до полного растворе- ния. После этого осуществляют газожидкостную хроматографию на хроматографе с пламенно-ионизированным детектором. Хроматографическую колонку (стеклянную) заполняют готовой насадкой-хроматоном N Super (0,125...0,160 мм), модифицированным жидкой фазой - силиконовым маслом OV-225 в количестве 5% от массы носителя. Снятие хроматограмм производят при температуре колонок 280-285°С.

Способ осуществляют следующим образом.

Навеску сухих дрожжей обрабатывают щелочью, смесь гидролизуют кипячением на водяной бане и экстрагируют гексаном. Экстракт обрабатывают насыщенным раствором иода в гексане, растворитель отгоняют, добавив несколько капель бензола, сухой остаток растворяют в гексане и раствор анализируют методом газожидкостной хроматографии.

На чертеже представлена хроматограм- ма анализируемой пробы кормовых дрожжей.

П р и м е р. В пробирку (или термостой- кую колбу) вместимостью 25-100 см3 помещают навеску сухих дрожжей в количестве 1 г и заливают 15 см спиртового раствора гидроокиси калия (12% КОН). Полученную смесь кипятят с обратным холодильником в токе азота в течение 1,5 ч на водяной бане. Полученный гидролизат охлаждают и переливают в делительную воронку с равным объемом дистиллированной воды. Затем неомыленную стероидную фракцию экстраги- руют гексаном 3 раза, добавляя каждый раз по 20 см . Объединенные гексановые вытяжки промывают дистиллированной водой до полного удаления щелочи (отсутствие щелочи проверяют с помощью индикатор- ной бумаги).

Для определения содержания витамина D2 в исследуемой пробе в виде трансвитамина к полученному ранее экстракту добавляют по каплям насыщенный раствор иода в гексане до появления устойчивого розового окрашивания. Растворитель отгоняют в токе азота на водяной бане, прибавляют в конце несколько капель бензола (5-6 капель), сухой остаток растворяют в гексане

до полного растворения и раствор хроматог- рафируют.

Хроматографическую колонку (стеклянную), промытую водой и этиловым спиртом, просушенную в токе воздуха, заполняют готовой насадкой-хроматоном N Super (0,125-0,160 мм), модифицированным жидкой фазой - силиконовым маслом OV-225 в количестве 5% от массы носителя. Колонку устанавливают в термостат хроматографа, продувают газом-носителем и насыщают ее раствором эргостерина и витамина D2 в гексане (делают 30-40 укалываний), После насыщения приступают к определению витамина D2, предварительно подготовив пробу.

Снятие хроматограмм проводят при следующих условиях:

температура, °С:

испарителя295

колонок280

Скорость диаграммной ленты, мм/ч240

Расход, см3/мин:

газа-носителя - гелия 60 водорода30

воздуха300

Объем вводимой

пробы, мкл5-10

На хроматограмме пик I характеризует наличие витамина Dj, который после введения дополнительной стадии обработки иодом в.ыходит в виде одного, а не двух пиков. Этот пик соответствует трансвитамину, в который под действием иода переходит витамин Da. В то же время иод не действует ни на эргостерин, ни на пиро- и изопировитамины, что характеризует надежность и селективность.способа.

При помощи предлагаемого способа анализа можно определить степень сохранности витамина D2 при сушке облученной биомассе.

Формула изобретения Способ хроматографического определения витамина D2 в кормовых дрожжах, включающий экстрагирование стероидной фракции анализируемой пробы органическим растворителем, хроматографическое разделение компонентов экстракта и определение содержания витамина D2 в соответствующей ему хроматографической зоне, отличающийся тем, что, с целью повышения селективности и упрощения способа, в экстракт стероидной фракции добавляют по каплям насыщенный раствор иода в гексане до появления устойчивого розового окрашивания, отгоняют растворитель, сухой остаток растворяют в гексане и

разделяют на стеклянной колонке с насадкой на основе силикагеля, модифицированной нитрилсиликоновым маслом, при 280- 285°С.

Назначение: способ относится к определению витаминов при производстве микробиологическим способом, а точнее к способам определения содержания витамина D2 в биомассе, и может быть использован при производстве дрожжей, обогащенных витамином D2. Навеску дрожжей гидролизу- ют, экстрагируют гексаном стероидную фракцию, обрабатывают насыщенным раствором иода в гексане до появления розового окрашивания с последующей отгонкой растворителя. Далее сухой остаток смачивают бензолом, добавляют гексан до полного растворения и осуществляют газожидкостную хроматографию на хроматографе с пла- менно-ионизационным детектором. Хроматографическую колонку (стеклянную) заполняют хроматоном N Super (0,125...0,160 мм), покрытым силиконовым маслом OV-225 в количестве 5% от массы носителя. Снятие хроматограмм производят при температурах: испарителя 293- 296°С, колонок 280-285°С. 1 ил.

5/0

/5 A.jb

10

/Чип-

10 О

.,п- 2.

50-/0