Способ подавления репродукции вирусов Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 C12Q1/70 

Изобретение относится к медицинской биохимии и касается способа подавления репродукции вируса антителами, специфическими к антигенным детерминантам этого вируса. Способ открывает новые перспективы в медицине, в частности в области создания противовирусной терапии а также в фундаментальных исследованиях: изучения механизмов вирусной репликации, действия компонентов иммунной системы и т.д.

Известен способ для подавления вирусной активности с помощью антител, специфических к антигенным детерминантам вируса.

Однако вследствие непроницаемости клеточных мембран для антител последние не могут взаимодействовать с внутриклеточными вирусными частицами и, следовательно, не способны оказывать влияние на репродукцию вируса, генактивируя только внеклеточные вирусные частицы.

Наиболее близким к предлагаемому по сущности и достигаемому эффекту является способ подавления репродукции вируса с помощью антител путем воздействия на зараженные вирусом клетки антителами, специфическими к антигенным детерминантам этого вируса, включенными в липосомы, поскольку липосомы могут обеспечивать доставку антител внутрь клетки. Культуру клеток ML инкубируют с липосомами из сфингомиелина, холестерина и стеарилами- на, содержащими иммуноглобулины G(lgG) с высоким титром к вирусу Коксаки А-21, и заражают этим вирусом. Через двое суток определяют инфекционную активность образовавшегося вируса. Для клеток, инкубированных с липосомами, наблюдают 23-74%-ное снижение инфекционной активности по сравнению с клетками, зараженными вирусом, но не инкубированными с липосомами.

VI

CJ

о

Ј

ь

Недостатками известного способа являются низкая эффективность противовирусного действия, а также сложность процедуры получения липосом, содержащих антитела, и низкая эффективность включения антител в липосомы, что приводит к значительным потерям антител при приготовлении противовирусного препарата, Кроме того способ характеризуется низкой стабильностью липосом, затрудняющей длительное хранение противовирусного препарата.

Цель изобретения - повышение противовирусного действия и упрощение способа,

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу в качестве противовирусных агентов используют специфические к антигенным детерминантам вируса антитела с ковалентно присоединенными к ним остатками жирных кислот.

Эффективность способа доказана на примерах подавления репродукции модельных вирусов, а именно вирусов гриппа различных серотипов и респира- торно-синтициального вируса. При действии на зараженные вирусом клетки антитела, специфичные к антигенным детерминантам этого вируса, с ковалентно присоединенными к ним остатками жирных кислот обеспечивают значительное подавление (на 1,5-2 порядка, см. табл. 1-3) репродукции вируса.

В качестве антител можно использовать иммуноглобулины различных классов и их суммарные фракции. В качестве модифицирующих антител реагентов можно использовать различные липиды - производные синтетических и природных жирных кислот.

П р и м е р 1. Получение антител, моди- фицированных остатками жирных кислот.

К 10 нм 0,1 М раствора натриевой соли ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтар- ной кислоты в октане добавляют 450 мкл 1 мМ раствора антител в 0,1 М боратном бу- фере, рН 9,5. Систему интенсивно перемешивают в течение 1-2 мин до появления оптической прозрачности, а затем добавляют к ней 450 мкл 5 мМ раствора хлорангид- рида или N-оксисукцинимидного эфира жирной кислоты (стеариновой или пальмитиновой, или миристиновой и др.) в октане. Через 2 ч белок осаждают из реакционной системы на холоде (0°С) 30 мл ацетона. Выпавший осадок отделяют и промывают 4-5 раз 30 мл холодного (4°С) ацетона.

Остаток ацетона удаляют на роторном испарителе.

Модифицированные антитела фракционируют гидрофобной хроматографией на

фенил-сефарозе и определяют выход модифицированного белка. Степень модификации иммуноглобулинов определяют, используя для модификации радиоактивно меченные жирные кислоты.

Аффинность антител определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа и методом радиоиммуноанализа.

Модифицированные антитела хранят в сухом состоянии при пониженной темпера- туре(-10--(-1ё)°С).

Выход Кодифицированных антител по белку составляет 95-100%. Модифицированные антитела содержат 1 остаток жирной кислоты на молекулу белка. Они сохраняют 80-100% специфической активности (аффинности) по сравнению с исходными (немодифицированными) антителами. При хранении в сухом состоянии в течение длительного времени (более года) активность модифицированных антител снижается не более чем на 20%.

П р м м е р 2, Репродукция вируса гриппа (штам А//Чили, серотип H1N1) в пермйссив- ных клетках МДСК.

Монослой пермиссивных клеток МДСК заражают вирусом гриппа (штамм А/чили, серотип H1N1) со множественностью 1-10 бляшкообразующих единиц на 1 клетку. Через 3.5 ч после заражения к клеткам добавляют антитела (нормальные кроличьи IgG; нормальные кроличьи IgG, модифицированные остатками жирной кислоты; специфические кроличьи IgG против вируса гриппа серотипа H1N1; специфические кроличьи IgG против вируса гриппа серотипа H1N1, модифицированные остатками жирной кислоты) в концентрации, равной их титру в ре акции торможения гемагглютинации. Через 8,5 ч после заражения клетки промывают 2 раза 2-кратным объемом среды, в течение 1 ч выдерживают с 2-кратным объемом среды, промывают 5-кратным объемом С|Ьеды и добавляют к ним свежую среду, не содержащую антител. | Через 24 ч после заражения отбирают культуральную среду, осаждают клетки и кле- тбчныйдебрис2-кратным центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин. В супернатанте определяют инфекционную активность в эмбриональныхинфекционныхдо- (ЭИДзд/мл) и гемагглютинирующую активность в реакции гемагглютинации с 0,7:% куриными эритроцитами (ГАЕ/мл),

Результаты приведены в табл.1.

Пример 3. Репродукция вируса гриппа (штамм А/Техас, серотип H3N2) в пермиссивных клетках МДСК.

То же, что в примере 2, но используют вирусы гриппа (штамм А/Техас, серотип

H3N2) и антитела, специфические к вирусу гриппа серотипа H3N2.

Результаты приведены в табл.2.

П р и м е р 4. Репродукция PC-вируса (штамма Long) в пермиссивных клетках Hela.

Монослой пермиссивных клеток Hela заражают респираторно-синтициальным вирусом (PC-вирусом) (штамм Long) со множественностью 1-10 цитопатических еди- ниц (ЦПДбо) на 1 клетку. Через 6 ч после заражения к клеткам добавляют антитела (нормальные кроличьи IgG; нормальные кроличьи IgG, модифицированные остатками жирной кислоты; специфические кроличьи IgG против PC-вируса; специфические кроличьи IgG против PC-вируса, модифицированные остатками жирной кислоты) в концентрации, равной их титру в реакции связывания комплемента с очи- щенным вирусом. Через 13 ч после заражения клетки промывают (как описано в примере 2) и добавляют к ним свежую среду, не содержащую антител.

Через 28 ч после заражения отбирают культуральную среду, осаждают клетки и клеточный дербис 2-кратным центрифугированием при 2000 об/мин в течение 25 мин. В супернатанте определяют инфекционную активность по циопатическому дей- ствию на культуре клеток Hela (ЦПДбо/мл).

Результаты приведены в табл.3.

Как показано в примерах (табл.1-3), подавление репродукции вируса путем воздействия на зараженные вирусом клетки антителами, специфическими к антигенным

детерминантам этого вируса, составляет 1,5-2 порядка, в то время, как в известном способе подавление не превышает 1 порядка. Сопоставление данных, приведенных в примерах и известном способе, свидетельствует о том, что подавление репродукции вируса требует по данному способу по крайней мере на 2 порядка меньших концентраций антител.

При получении противовирусных агентов путем модификации специфических к антигенным детерминантам вируса антител остатками жирных кислот выход модифицированных антител составляет 95-100% в то время как в известном способе не более 10% взятых антител удается включить в ли- посомы. Кроме того, антитела с ковалентно присоединенными к ним остатками жирных кислот можно хранить в сухом состоянии в течение длительного времени (более 1 года) без значительной потери специфической активности, в то время как противовирусные агенты, используемые в известном способе (антитела, включенные в липосомы) нельзя хранить более нескольких дней. Формула изобретения Способ подавления репродукции вирусов путем воздействия на зараженные вирусом клетки иммобилизованными антителами, специфическими к антигенным детерминантам этого вируса, отличающийся тем, что, с целью повышения противовирусного действия и упрощения способа, используют антитела с ковалентно присоединенными к ним 1-2 остатками жирных кислот.

Таблица 1

Использование: медицинская биохимия. Сущность изобретения: в способе подавления репродукции вирусов в качестве противовирусных агентов используют антитела с ковалентно присоединенными к ним остатками жирных кислот. При этом эффективность подавления репродукции вирусов составляет 1,5-2 порядка. Выход противовирусных агентов составляет 90-100% от исходных антител, препараты стабильны в течение года. 3 табл. сл с

Репродукция вируса гриппа (штамм А/Чили, серотип H1N1) в пермиссивных клетках МДСК

(пример 2)

Условия эксперимента

Инфекционная активность через 24 ч. Ig (ЭИДэо/мл)

Зараженные клетки не инкубируют с антителами Зараженные клетки

инкубируют с: нормальными IgG кролика нормальными IgG кролика, модифицированными остатками

стеариновой кислоты нормальными IgG кролика, модифицированными остатками

пальмитиновой кислоты

специфическими IgG кролика

против вируса гриппа ееротина

H1N1

Гемагглютинирующая актив- ность через 24 ч (ГАЕ/мл)

8 8 8 8

специфическими IgG кролика против вируса гриппа сероти- на H1N1, модифицированными остатками стеариновой

кислоты

специфическими IgG кролика против вируса гриппа сероти- на H1N1, модифицированными остатками пальмитиновой кислоты

Таблица 2

Репродукция вируса гриппа (штамм А/Техас, серотип H3N2) в пермиссивных клетках

МДСК (пример 3).

Условия эксперимента

Инфекционная активность через 24 ч. Ig (ЭИДзо/мл)

Зараженные клетки не инкубируют с антителами Зараженные клетки

инкубируют с:. нормальными IgG кролика нормальными IgG кролика, модифицированными остатками

стеариновой кислоты нормальными IgG кролика, модифицированными остатками

миристиновой кислоты

специфическими IgG кролика

против вируса гриппа серотина

H3N2

специфическими IgG кролика против вируса гриппа серотина H3N2, модифицированными остатками стеариновой кислоты специфическими IgG кролика против вируса гриппа серотина H3N2, модифицированными ос- татками миристиновой кислоты

Таблица 3 Репродукция PC-вируса (штамм Long) в пермиссивных клетках Hela (пример 4)

Условия эксперимента

Зараженные клетки не инкубируют

с антителами Зараженные клетки инкубируют с:

нормальными IgG кролика нормальными IgG кролика, модифицированными остатками стеариновой кислоты специфическими IgG кролика против РС-ви- руса

Продолжение табл. 1

3,5

3,5

Гемагглютинирующая активность через 24 ч (ГАЕ/мл)

512 512 512 512 512

128 128

Инфекционная активность через 28 ч, Ig (ЦПДво/мл)

5,4 5,5 5,5 5,3

Продолжение табл. 3