СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И АМИНОКИСЛОТ ИЗ АВТОЛИЗАТОВ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ Российский патент 1999 года по МПК C12P21/06 C07H21/00 A23J1/18 

Изобретение относится к области фармацевтической и пищевой промышленности, к способу выделения смесей нуклеиновых и аминокислот из автолизатов пекарских дрожжей.

Изобретение может быть использовано в медицине, фармацевтической промышленности и в сельском хозяйстве /балансирование кормов в животноводстве и птицеводстве/.

Автолизаты дрожжей содержат клеточные оболочки, нуклеиновые и аминокислоты, низшие пептиды, различные пигменты. Вещества, сопутствующие целевому продукту, затрудняют кристаллизацию и снижают выход нуклеиновых кислот и аминокислот и должны быть удалены из раствора. Известно применение ионитов в H⁺ и OH^- форме и макропористого анионита ИА-Ip /А.с. СССР N 602543/ [1].

Наиболее близким по технической сущности процессом является способ выделения нуклеиновых компонентов и аминокислот из автолизатов дрожжей [2], принятый нами за прототип. Способ заключается в том, что исходный автолизат пропускают сначала через макропористый анионит ИА-Ip в гидроксильной форме для обесцвечивания раствора, поглощения пептидов и нуклеиновых компонентов, а затем через сульфокатионит КУ-2-8 в водородной форме, на котором происходит сорбция аминокислот. Процесс осуществляли путем пропускания 70 мл автолизата, из которого предварительно удаляли центрифугированием остатки клеточных оболочек, через последовательно соединенные колонки с анионитом ИА-Ip в гидроксильной форме /объем ионита 10 мл, колонка 18 х 1,6 см/ и катионитом КУ-2-8 в водородной форме /объем смолы 30 мл, колонка 22 х 2,2 см/. Предварительно анионит ИА-Ip переводили в гидроксильную форму 6 объемами 0,5 н OH и отмывали дистиллированной водой до pH фильтрата 9,0 - 9,5 /50 объемов воды на объем смолы/; сульфокатионит КУ-2-8 обрабатывали 5 объемами 1н HCl и отмывали дистиллированной водой до pH 4,5. Скорость пропускания автолизата через колонки с ИА-Ip и КУ-2-8 - 40 мл/ч. Затем анионит промывали 30 - 40 мл дистиллированной воды и регенирировали 6 объемами 0,5 н NaOH. Катионит промывали 200 мл воды. Десорбцию смеси аминокислот с катионита осуществляли 150 мл 1 - 1,5% раствора аммиака. Собирали фракции отдельно до значения pH ≤ 4,5 и со значениям pH ≥ 4,5. Нейтрально-щелочные фракции упаривали для удаления аммиака, добавляли воду (3 раза по 15 мл), затем объединяли кислую и нейтрально-щелочную фракции. Смесь аминокислот упаривали в роторном испарителе при 40^oC почти досуха и досушивали в вакуум-сушильном шкафу над окисью фосфора.

Недостатками этого способа являются: использование нескольких видов ионитов, нуклеиновая фракция загрязнена пигментами, значительный расход реагентов и воды, многостадийность процесса (более 10 операций).

Целью настоящего изобретения является устранение указанных недостатков, а именно: сокращение числа стадий процесса выделения нуклеиновых и аминокислот из автолизатов пекарских дрожжей, уменьшение количества и типов используемых сорбентов, уменьшение расхода реагентов и сокращение количества промывных вод и элюатов.

Эта цель достигается тем, что в качестве сорбента используют сверхсшитый полистирольный сорбент Cтиросорб, который получают путем сшивания линейного полстирола монохлордиметиловым эфиром в среде циклогексана по реакции Фриделя - Крафтса. Степень сшивки трехмерного сорбента составляет 100%, структура сорбента составлена из фрагментов: - CH₂-CH-C₆H₄-CH₂-C₆H₄-CH-CH₂- Стиросорб хорошо поглощает гидрофобные органические вещества. В связи с отсутствием функциональных групп, способных к обмену, Cтиросорб не сорбирует аминокислоты. При пропускании автолизата пигментные вещества и нуклеиновые кислоты поглощаются сорбентом. Таким образом достигается разделение аминокислотной и нуклеиновой фракцией с использованием только одного вида сорбента. Подбор элюентов, вытесняющих их смолы отдельно нуклеиновые кислоты и пигменты, позволяет получить растворы, содержащие только целевые продукты. Сухие смеси нуклеиновых и аминокислот получают путем упаривания и кристаллизации. Выходы целевых продуктов (нуклеиновых и амнокислот) составляет 70 - 80%. Регенерация Стиросорба осуществляется промыванием 1М раствором NaOH В способе - прототипе при элюировании со смолы целевого продукта одновременно происходит и десорбция окрашенных веществ, кроме того, необходима нейтрализация элюатов с обеих колонок. Предлагаемый способ лишен указанных недостатков.

Для лучшего понимания изобретения ниже приводятся следующие примеры.

Примеры.

1. Автолизат, содержащий нуклеиновые кислоты 0,095 г/л и сумму аминокислот 26,824 г/л. C_Σa.к./C_Σн.к. = 282,36.

Для разделения нуклеиновых и аминокислот использовали колонку с объемом сорбента V = 10 мл, d колонки = 1,2 см, h колонки = 8,3 см. Скорость пропускания раствора на всех операциях V линейная = 2 м/ч (2 мл/сек). pH автолизата = 5,2.

1.1. Пропущено 100 мл автолизата. Полное насыщение колонки наступает при пропускании 80 мл (V р-ра/V смолы = 8). При этом сорбент поглощает 69,18% (581•10^-5) нуклеиновых кислот, содержащихся в автолизате. На этой же операции после контакта с сорбентом в фильтрате обнаружено 92,85% суммы аминокислот от исходного автолизата. При этом цветность автолизата уменьшается на 50%.

1.2. Отмывку водой проводили 50 мл (V/V_o = 5). При этом вытеснялось из колонки 5,68% нуклеиновых кислот (от всех сорбированных) и 5,86% аминокислот от исходного содержания в автолизате, причем фильтрат не имел окраски.

1.3. Элюирование нуклеиновых кислот проводят 1М раствора NaCl, V р-ра/V сорб = 10. Элюируется 100% от общего содержания нуклеиновых кислот, поглощенных сорбентом. Выход нуклеиновых кислот 63,50% от исходного содержания в автолизате. Причем пигменты, поглощенные сорбентом, не вымываются, элюат получается бесцветный.

1.4. Регенерацию сорбента проводят 10 объемами (V р-ра/V смолы = 10) 0,5М раствором NaOH, при этом происходит полное удаление окрашенных веществ из фазы сорбента.

2. Автолизат, содержащий нуклеиновые кислоты 7,6 г/л и сумму аминокислот 25 г/л. C_Σa.к./C_Σн.к. = 3,29
Для разделения нуклеиновых и аминокислот использовали колонку с объемом V_o = 10 мл, d = 1,2 см, h = 8,3 см. Скорость пропускания растворов на всех операциях V линейная = 2 м/ч) 2 мл/мин) pH автолизата без корректировки.

2.1. Пропущено 100 мл автолизата, полное насыщение колонки происходит при пропускании 60 мл (V/V_o = 6). Поглощается смолой 29,34% нуклеиновых кислот, содержащихся в автолизате (0,1338 г). После контакта с сорбентом в фильтрате обнаружено 95,18% суммы аминокислот исходного автолиза. При этом цветность автолизата уменьшилась на 50%.

2.2. Отмывку водой осуществляли 50 мл (V/V_o = 5). При этом вытеснялось из колонки 71,22% нуклеиновых кислот (0,0953 г).

2.3. Элюирование нуклеиновых кислот производили 1М раствором NaCl, V/V_o = 10, вытеснено 0,0286 г (из оставшихся на колонке 0,0385), что составляет 24,28% от сорбированного количества, или 6,27% от исходного содержания в 100 мл автолизата. При этом окрашенные вещества не вымываются, элюат бесцветный.

3. Автолизат, содержащий нуклеиновые кислоты 0.025 г/л и сумму аминокислот 15 г/л C_Σa.к./C_Σн.к. = 600. Для разделения нуклеиновых и аминокислот использовали колонку с объемом сорбента 14,7 мл, d колонки = 1,2 см, h колонки = 14,27 см. Скорость пропускания растворов = 2 м/ч/2мл/мин, pH = 5,3.

3.1. Пропущено 10 фракций автолизата по 14,7 мл до полного насыщения колонки, при этом сорбент поглощает 89% /3,27•10^-3/ нуклеиновых кислот, содержащих в автолизате. На выходе из колонки обнаружено 95,17% суммы аминокислот от исходного содержания. Цветность фильтрата снизилась на 62%.

3.2. На отмывку водой израсходовали 50 мл V/V_o= 5, при этом вытеснилось из колонки 5,3% нуклеиновых кислот /от всех сорбированных/ и 4,4% аминокислот, фильтрат не имел окраски.

3.3. Элюирование нуклеиновых кислот осуществляли 1M раствором NaCl. Первыми 4 объемами вытесняется 80% сорбированных нуклеиновых кислот, а остальное 20% - последующими 3 объемами, при этом пигменты, поглощенные сорбентом, не вымываются, элюат бесцветный.

Источники информации
1. В.М.Беликов, С.В.Гордиенко и др. Способ получения смеси аминокислот и низших пептидов (А.с. N 602543).

2. В. А. Попова, С.В.Гордиенко, Д.И.Островский. Влияние pH на эффективность очистки автолизата дрожжей на ионообменных смолах. - сб. Теория и практика сорбционных процессов, 1985 г. вып. 17, с. 61 - 65.3

Изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности и может быть использовано для получения нуклеиновых кислот и аминокислот. Автолизат дрожжей пропускают через сорбент Стиросорб. Непосредственно из фильтрата выделяют аминокислоты, а нуклеиновые кислоты элюируют 1 М раствором хлористого натрия. Способ позволяет увеличить выход целевого продукта до 70-80%.

1. Способ получения нуклеиновых кислот и аминокислот из автолизатов пекарских дрожжей, включающий пропускание автолизатов через сорбент и выделение целевых продуктов, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют сверхсшитый сорбент Стиросорб, аминокислоты выделяют непосредственно из фильтрата, полученного после пропускания автолизата через сорбент, а нуклеиновые кислоты элюируют 1M раствором хлористого натрия. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после элюции нуклеиновых кислот Стиросорб регенерируют 1M раствором гидроксида натрия для удаления сорбированных пигментов.