Способ диагностики коклюша Советский патент 1992 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в медицине для диагностики коклюша.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности способа обнаружения коклюшного антигена в материале из зева обследуемого.

Способ осуществляется следующим образом.

Забор материала из зева обследуемого производят таднеглоточным тампоном, укрепленным на металлической л

проволоке, изогнутой под углом 120°, увлажненным стерильным физиологическим раствором (0,85% раствора хлорида натрия). Данный тампон не используют для посева на питательную среду. В пробирку с тампоном добавляют 3-4 стеклянные бусинки диаметром 6,0 мм, предназначенные для дефибринирования крови и 0,15 мл стерильной дистиллированной воды, содержимое пробирки встряхивают вручную в течение 1 мин. Готовят три препарата: один опытный и два для контроля иммунологической специфичности, используемые в качест

оо

ГчЭ

ч|

1732278

ве отрицательного и положительного коитролей. Для приготовления двух пер.вых препаратов (опытного и отрицательного контрольного) на два обезжиренных предметных стекла наносят по одной капле исследуемого субстрата пастеровской пипеткой из пробирки с тампоном. Для приготовления мазка, используемого в качестве положительного контроля, на обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора и петлей наносят культуру В.pertussis. После подсушивания на воздухе все три препарата фиксируют в течение 20 мин в этиловом спирте, охлажденном в морозильной камере холодильника. Мазки на высохших стеклах обводятся с обратной стороны препарата карандашом по стеклу для облегчения последующего просмотра под микроскопом. Затем препараты по-1 мещаются во влажную камеру и на них наслаивают кроличью коклюшную гипериммунную агглютинирующую сыворотку с титром не ниже 1:25600 и разведении 1:100, отцентрифугированную при 3000 об/мин в течение 10 мин. Все разведения сывороток производят в за- буференном физиологическом растворе (состав: NaCl 8,65 г; Na2HP04 1,92 rj КН2Р04 0,44 г; дистиллированной воды 1000 мл; рН 7,2-7,4); автоклавиру- ют 30 мин при 0,5 атм. В качестве влажной камеры можно использовать стерилизатор с небольшим количеством теплового физиологического раствора на дне, помещая стекла на перевернутую вверх дном сетку стерилизатора. С закрытой крышкой стерилизатор ставят в термостат при 37°С на 15 мин. Затем препараты тщательно промываются поочередно в двух стаканах с буферным физиологическим раствором по 5 мин с помощью пинцета и подсушиваются на воздухе в вертикальном положении на фильтровальной бумаге. На два препа- рата (опытный и положительный контроль) наливают люминесцирующую сыворотку против глобулинов.кролика в разведении 1:10, а на препарат, используемый в качестве отрицательного контроля, наслаивают люминесцирующую сыворотку против глобулинов лошади в разведении 1:10 производства того же института. (Люминесцирукщие сыворотки в рабочем разведении необходимо цент- рифуппзовать при 3000 об/мин в тече- ние 10 мин). Далее все препараты выдерживают во влажной камере при 379С в течение 15 мин, после чего аккуратно промывают дважды в свежем буферном

физиологическом растворе по 5 мин с помощью пинцета, сушат а воздухе в вертикальном положении и просматривают под люминесцентным микроскопом. Микроскопию проводят в подающем свете с

использованием фильтров ФС 1-2, БС /8-2, СЗС 7-2. Запирающий фильтр Т-2-Н, объектив 90х, окуляр 10х сила тока при микроскопии 4,5-5 А. Для микроскопии применяется нефлюоресцирующее

5 иммерсионное масло П 1,516. Для оценки-интенсивности свечения используется четырехкрестовая система: ++++ очень яркая люминесценция по периферии клетки, +-++ яркая люминесценция

периферии клетки, ++ или + слабое

свечения периферии клетки/ - люминесценция клеток отсутствует. Положительным результатом считается люминесценция клеток, оцениваемая на + +

и +++. Такое свечение должно быть в препарате, используемом в качестве положительного контроля. В препарате, используемом в качестве отрицательного контроля, специфическое свечение

0 не должно наблюдаться.

Опытный препарат необходимо просмотреть не менее, чем в 50 полях зрения и при наличии 3-4 и более специфически светящихся клеток, резуль5 тат считать положительным. При обнаружении аналогично светящихся микробных клеток/в препарате, используемом в качестве отрицательного контроля, результат считается отрицательным.

0 Остальные контроли необходимо ставить при использовании новых серий гипериммунной и люминесцирующей сывороток.

Исследования показали возможность

5 использования в качестве коклюшной гипериммунной агглютинирующей сыворотки коммерческой коклюшной агглютинирующей сыворотки, полученной путем иммунизации ослов при наличии У

0 коммерческой люминесцирующей сыворотки против глобулинов осла (использовалась экспериментальная серия гцю- . изводства того же института). Для постановки непрямого иммуиофлю5 оресцентного метода при диагностике коклюша.

Непрямой иммунофлюоресцентный метод также может быть использован для идентификации выделенных культур,

что особенно важно при исследовании атипичных штампов.

При разработке предлагаемого метода проводили сравнительные исследования по отбору жидкости, применяемой для смачивания тампонов при заборе материала с задней стенки глотки. Исследовались следующие жидкости: физиологический раствор (0,85% раствор хлористого натрия), физиологический раствор, забуренный фосфатами, смесь Кузнецова, применяемая для увлажнения тампонов при обследовании на коклюш,

содержащая кроме физиологического ра- 15 обтряхивания тампона, содержащего ис20

25

30

створа активированный уголь, агар- агар и фосфатный буфер.

Было показано, что использование для смачивания тампона физиологического раствора одновременно с обтряхиванием тампона стеклянными бусами диаметром 6,0 мм обеспечивает получение сверхсуммарного результата.

Известный метод смачивания тампонов питательной средой не использовался. Питательная среда, например г сыворотка крови, используется при бактериологическом исследовании для смачивания тампона в качестве транспортной среды, рассчитанной на сохранение жизнеспособности микробов и подращивание их в процессе транспортировки в течение нескольких часов. При исследовании НИФ-методом смачивание тампона физиологическим раство- 35 ром применялось лишь для улучшения его адсорбционных свойств, а не как питательная среда для микробов, так как неважно, живой или погибший микроорганизм будет в дальнейшем реагировать с иммунной сывороткой.

Проводилось также сравнительное исследование по подбору оптимального количества дистиллированной воды, в которой встряхивался тампон с бусами. Расчет добавляемой дистиллированной воды делался не из объема, необходимого для смачивания ватного тампона (так как тампон, предварительно увлажненный физиологическим раствором перед забором материала, больше жидкости не впитывал), а определялся минимальной величиной, которая бы обеспечивала наибольшую концентрацию микробов в единице объема и почти полностью использовалась при приготовлении препаратов. Исследовались три объема: 0,5 мм, 0,25 мм и 0,15 мл. Так как для приготовления препаратов

следуемый материал. Пооволились исследования по использованию для обтряхивания тампона в 0,15 мл дистиллированной воды мелких стеклянных бус диаметром 3,0 мм, а также крупных стеклянных бус с диаметром 6,0 мм, которые обычно применяются только для дефибринировання крови, а для обтряхивания тампонов никем не применялись Для контроля исследовалось обтряхивание тампона без бус. Исследовались взвеси коклюшных бактерий в концентрациях 10, 10б, 10у и 10 микробных клеток в 1 мл.

Было показано, что использование мелких стеклянных бус при встряхивании не обеспечивает эффекта выколачивания микробов, так как масса бусинок, а следовательно, и их ударная сила очень мала. Тогда как стеклянные бусы с диаметром 6,0 мм обеспечивают более высокую концентрацию микробов в исследуемой жидкости и потому существенно повышают чувствительность и точность метода.

Предлагаемый способ превосходит известный по чувствительности за счет использования непрямой реакции имму-- нофлюоресценции вместо прямой, применения отдельного тампона, Tie ис- з пользованного предварительно для производства бактериологического посева, увлажнения тампона перед забором материала, что улучшает условия забора, сохранность материала при транспортировке в лабораторию, использования при встряхивании крупных стеклянных бус с диаметром 6,0 мм, значительно увеличивающих концентрацию микробов 55 в исследуемом субстрате по сравнению с известным способом и унифирует ус- v ловия обогащения исследуемого субстрата при встряхивании, так как прили-1 ваемая дистиллированная вода не впи40

45

50

использовались две крупные капли, при исследовании первых двух объемов большая часть взвеси оставалась неиспользованной. Это понижало шансы на обнаружение возбудителя коклюша. К тому же и концентрация микробов в этих взвесях была меньше. При обтряхивании тампона в 0,15 мл дистиллированной I воды весь объем исследуемой жидкости полностью использовался для приготов- - лення препарата.

Для повышения чувствительности метода большое значение имеет способ

0

5

0

5

следуемый материал. Пооволились исследования по использованию для обтряхивания тампона в 0,15 мл дистиллированной воды мелких стеклянных бус диаметром 3,0 мм, а также крупных стеклянных бус с диаметром 6,0 мм, которые обычно применяются только для дефибринировання крови, а для обтряхивания тампонов никем не применялись. Для контроля исследовалось обтряхивание тампона без бус. Исследовались взвеси коклюшных бактерий в концентрациях 10, 10б, 10у и 10 микробных клеток в 1 мл.

Было показано, что использование мелких стеклянных бус при встряхивании не обеспечивает эффекта выколачивания микробов, так как масса бусинок, а следовательно, и их ударная сила очень мала. Тогда как стеклянные бусы с диаметром 6,0 мм обеспечивают более высокую концентрацию микробов в исследуемой жидкости и потому существенно повышают чувствительность и точность метода.

Предлагаемый способ превосходит известный по чувствительности за счет использования непрямой реакции имму-- нофлюоресценции вместо прямой, применения отдельного тампона, Tie ис- з пользованного предварительно для производства бактериологического посева, увлажнения тампона перед забором материала, что улучшает условия забора, сохранность материала при транспортировке в лабораторию, использования при встряхивании крупных стеклянных бус с диаметром 6,0 мм, значительно увеличивающих концентрацию микробов 5 в исследуемом субстрате по сравнению с известным способом и унифирует ус- v ловия обогащения исследуемого субстрата при встряхивании, так как прили-1 ваемая дистиллированная вода не впи0

5

0

17швается увлажненным тампоном. Пред- лдгаемый способ превосходит известный и по специфичности, поскольку он уменьшает количество ложноположитель ных реакций за счет выявления неспе- цифического свечения в контрольных . препаратах.

Пример 1. Непрямым иммуно- флюоресцентиым методом обследовано 135 детей, из них 48 с подозрением на коклюш, 39 - контактировавших с больными коклюшем, 4 ребенка с подтвержденным диагнозом ОРЗ коккавой этиологии и 44 здоровых ребенка.

Для выявления чувствительности НИФ-метода все дети с подозрением на коклюш и контактировавшие с больными коклюшем подвергались также бактериологическому и серологическому исследованиям. НИФ-метод был положителен у 54 детей из 87. Все случаи положительных результатов при НИФ исследовании подтверждены серологическим методом, а 12 - еще и бактериологическим.

Здоровые дети и больные ОРЗ помимо НИФ метода также исследовались бактериологическим методом. Результаты исследований у всех детей были отрицательными.

Таким образом, НИФ метод чувствительнее бактериологического Кроме того, он обладает рядом преимуществ по сравнению с серологическим методом: позволяет избежать негативных

моментов, связанных с двукратным забором крови для реакции агглютинации, дает возможность выявления коклюшного антигена в течение всего срока заболевания, начиная с первых дней результат НИФ может быть получен в течение нескольких часов.

8

Доказано, что исследуемые штаммы В.pertussis дают яркое специфическое свечение в опытных препаратах и не дают свечения или светятся на +. в контрольных препаратах. Специфическое (иногда неспецифическое, но яркое) свечение на ++++ и на +++ в опытных препаратах дают также 40% исследованных штаммов S.aureus,однако все они светятся и в контрольных препаратах на , +++ или ++, т.е легко отличаются от В.pertussis, штаммы которого в контрольных препаратах либо не дают свечения, либо светятся на +. Кроме того, светящиеся стафилококки легко отличить от коклюшных палочек по морфологии и по неспецифическому (всей поверхностью микробной клетки) свечению.

Формула изобретения

Способ диагностики коклюша путем забора исследуемого материала из зева обследуемого носоглоточным тампоном, помещения его в дистиллированную воду со стеклянными бусами и встряхивания с последующим исследованием приготовленных проб жидкости в реакции иммунофлюоресценции, о т л и - чающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специ- - фичности способа, перед забором материала тампон увлажняют в 0,85%-ном растворе хлорида натрия, встряхивание тампона проводят в 0,15 мл дистиллированной воды в присутствии 3-4 стек- лянных бус диаметром 6 мм, а исследованне проб жидкости осуществляют в непрямой реакции иммунофлуоресценции.

Изобретение относится к области микробиологии и может бить использовано в медицине для диагностики коклюша. Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности способа диагностики коклюша. Цель достигается тем, что используют непрямой иммунофлюоресцентный метод для обнаружения коклюшного антигена в материале с задней стенки глотки, забираемом с помощью отдельного зад- неглоточного тампона, увлажненного в 0,85%-ном растворе хлорида натрия с последующим добавлением к нему 0,15 мл дистиллированной воды и га- щением исследуемого субстрата путем встряхивания в течение 1 мин со стеклянными бусами диаметром 6,0 мм, обычно используемыми для дефибринирования крови. Предлагаемый способ превосходит по чувствительности и специфично сти известный способ определения коклюшного антигена с помощью прямой реакции иммунофлюоресценции: уменьшает количество ложноположительных результатов за счет выявления неспецифических реакций на контрольных препаратах, повышает чувствительность метода за счет использования для обтряхивания тампона крупных Л еклян- ных бус диаметром 6,0 мм. (Л