Способ получения иммунной сыворотки к риккетсиям Провачека Советский патент 1992 года по МПК A61K39/40 A61K39/118 

Изобретение относится к медицине, к медицинской микробиологии, и может быть использовано для получения специфических иммунных сывороток к риккетсиям Провачека, которые применяются для диагностики эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля.

Известен способ получения иммунных сывороток к риккетсиям Провачека с использованием в качестве иммуногенного средства химической сыпнотифозной вакцины.

Однако этот способ не позволяет получить иммунные сыворотки с высокой специфической активностью

Цель изобретения - повышение специфической активности иммунных сывороток, что даст возможность улучшить качество целевого продукта, значит, более эффективно осуществлять лабораторную диагностику эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля.

Указанная цель достигается тем, что для иммунизации лабораторных животных используют химическую сыпнотифозную вакцину, конъюгированную с фосфолипидным антигенным комплексом риккетсий Провачека. Соотношение ингредиентов: 0,5 мл вакцины, содержащей 48 антигенных единиц (АЕ) и 5± мг фосфолипидного антигенного комплекса, содержащего 80 - 240 АЕ.

Х|

IOJ Сл) О О 4

В состав иммуногенного средства дополнительно вводят фосфолипидный антигенный комплекс риккетсий Провачека, на основе которого готовят липосомы, инкапсулирующие сыпнотифозную вакцину.

Объем вакцины 0,5 мл со специфической активностью 48 АЕ - форма выпуска коммерческого препарата, разовая доза химической сыпнотифозной вакцины, используемая для иммунизации. Концентрация фосфолипидного антигенного комплекса 5 ± 1 мг со специфической активностью 80 - 240 АЕ обеспечивает максимальный положительный эффект.

Способ осуществляют следующим образом.

Инфицированные риккетсиями Прова- чека куриные эмбрионы, специфически погибшие на 4 - 6 сут после заражения вскрывают. Извлекают желточные мешки и тщательно гомогенизируют в колбе со стеклянными бусами. Готовят 10%-ную маточную суспензию на физиологическом растворе рН - 7,0. Для инактивации возбудителя добавляют фенол в конечной концентрации 0,5% и выдерживают 10-12 сут при +4°С. Затем полученную суспензию заливают наркозным зфиром, соотношение эфира и материала 1,5:1,0, Колбы помещают в рефрижератор при +4°С на 18 ч, после чего наблюдается расслоение исходной суспензии на 3 слоя, Поверхностный эфирный слой переносят в стеклянную колбу с бусами. Тканевую фазу переносят в другую стерильную колбу с бусами, постепенно нагревают на водяной бане до 50 - 65°С до полного удаления эфира (исчезновение запаха), охлаждают до 18 - 25°С и добавляют фенол до 2 - 3%-ной концентрации, вновь постепенно нагревают на водяной бане до 100°С и выдерживают в течение 20 мин при этой температуре, затем остужают и вновь заливают наркозным эфиром. Соотношение эфира и материала 10:1. Колбы выдерживают при 4°С в течение 2 - 16 ч. Затем эфир переносят в колбу с эфирной фракцией, полученной при расслоении исходной суспензии; приготовленную эфирную смесь выпаривают при частичном вакууме с помощью специального аппарата при 40 - 42°С. К полученному осадку добавляют равный объем химически чистого ацетона. Материал помещают на водяную баню при 55°С на 1 ч, после чего ацетон удаляют.

Приготовленный осадок растворяют в хлороформе из расчета 0,1 мл на 1 желточный мешок. Из полученного раствора берут выемку для определения сухого веса и серологической активности по реакции связыеа- ния комплемента (РСК). Хлороформ

тщательно отгоняют в токе азота. Определив сухой вес и активность фосфолипидного антигенного комплекса в РСК по иммунной гомологичной сыворотке, вычисляют его

удельную серологическую активность (УСА) на 1 мг сухого веса. Ее определяют отношением титра фосфолипидного антигенного комплекса по РСК к сухому весу.

Иммуногенное средство готовят тща0 тельным диспергированием с помощью шприца 4 мг фосфолипидного антигенного комплекса активностью 80-160 АЕ в 0,5 мл химической сыпнотифозной вакцины, содержащей 48 АЕ. Приобретение системой

5 белого цвета свидетельствует о липстроп- ном метаморфозе - образовании липосом. Приготовленное иммуногенное средство вводят однократно внутримышечно лабораторным животным (кроликам, морским

0 свинкам). В результате получают выраженные сероконверсии у иммунизированных животных (см.таблицу). Уровень накопления специфических антител в сыворотках иммунизированных животных в зависимости от

5 концентрации и содержания АЕ фосфолипидного антигенного комплекса в иммуно- генном средстве приведен в таблице.

Наиболее качественный конечный продукт получали при концентрации в иммуно0 генном средстве фосфолипидного антигенного комплекса 5 ± 1 мг активностью 80 - 240 АЕ.

Фосфолипидные антигенные комплексы риккетсий Провачека с УСА более, чем 40

5 АЕ на 1 мг не удается извлекать из овокуль- тур. Использование для приготовления иммуногенного средства фосфолипидных антигенных комплексов с УСА менее, чем 10 АЕ на 1 мг не обеспечивает получения им0 мунных сывороток с достаточно высокой специфической активностью. В свою очередь увеличение в иммуногенном средстве концентрации фосфолипидного антигенного комплекса до 7 мг и выше ведет к длитель5 ному его депонированию и образованию абсцессов у иммунизированных животных. Положительный эффект от использования изобретения заключается в получении иммунных сывороток к риккетсиям Проваче0 ка с высокой специфической активностью, лишенных тканевого балласта. При этом иммунные высокотитровые сыворотки можно получить при однократном введении иммуногенного средства.

5Формула изобретения

Способ получения иммунной сыворотки к риккетсиям Провачека, включающий иммунизацию животных химической сыпнотифозной вакциной с последующим отбором крови и выделением целевого продукта, о тличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности сыворотки, для иммунизации используют смесь вакцины с фосфолипидным антигенным комплексом риккетсий Провачека с активностью 80 - 240 АЕ из расчета 5 ± 1 мг на одну дозу вакцины.

Использование медицина, микробиология, диагностические исследования. Сущность изобретения куриные эмбрионы, погибшие на 4 - 6-е сутки после заражения, вскрывают, извлекают желточные мешки, готовят 10%-ную маточную взвесь. Инактивируют ее в течение 10-12 сут 0,5%-ным фенолом при 4иС. Экстрагируют эфиром в течение 18 ч, выделяют тканевую фазу. В тканевую фазу добавляют фенол до 2 - 3% концентрации, прогревают при 100°С в течение 20 мин, потом вновь экстрагируют эфиром, выпаривают, а к полученному осадку добавляю равный объем ацетона. Смесь прогревают при 55°С в течение 1 ч, после чего ацетон удаляют, а осадок растворяют в хлороформе и получают таким образом фос- фолипидный антигенный комплекс. Имму- ногенноесредствоготовят диспергированием 4 кг фосфолипидного антигенного комплекса активностью 80-160 А.Е. в 0,5 мл химической сыпнотифозной вакцине, содержащей 48 АЕ Получение суспензии белого цвета свидетельствует о образовании липосом. Однократная иммунизация животных этими липосомами позволяет получать сыворотки с высоким титром. 1 табл. Ј

Примечание: титры антител даны в виде обратных величин средней

арифметической по 5 кроликам и 10 морским свинкам в каждой серии опытов.